王星天，李桂水，程麗君，李 毅，陶思佚，張 冰（天津市輕工與食品工程機(jī)械裝備集成設(shè)計(jì)與在線監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，天津　300222）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葉茶中游離氨基酸與多酚的提取工藝

王星天，李桂水*，程麗君，李 毅，陶思佚，張 冰
（天津市輕工與食品工程機(jī)械裝備集成設(shè)計(jì)與在線監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，天津300222）

為了使桑葉茶飲料達(dá)到較好的口感和較高營養(yǎng)價(jià)值，通過水浸提法同時(shí)提取桑葉茶中游離氨基酸與多酚兩種成分，利用響應(yīng)面法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，桑葉茶最佳的浸提條件是浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1 （mL/g）、浸提時(shí)間16 min。該條件下得到的游離氨基酸提取量為21.46 mg/g，多酚提取量為14.32 mg/g，與理論值誤差較小，說明通過Design-Expert軟件建立的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可行，優(yōu)化的浸提工藝穩(wěn)定可靠，為桑葉茶飲料開發(fā)的相關(guān)研究提供了參考。

桑葉茶；響應(yīng)面法；多酚；游離氨基酸；提取

桑葉又稱“東方神仙葉”，富含多種氨基酸、多酚、維生素、礦物質(zhì)、植物纖維以及豐富的鉀、鈣，還有多種對(duì)人體有益的微量元素及多種生物活性物質(zhì)［1-2］。其中氨基酸不僅是構(gòu)成茶葉品質(zhì)滋味的重要組成部分，而且它們對(duì)茶葉香氣的形成也有重要作用，在茶葉領(lǐng)域中的相關(guān)研究［3］表明，茶葉中氨基酸含量是決定茶葉品質(zhì)級(jí)別的主要因素。桑葉茶中的多酚包括槲皮苷、槲皮素、綠原酸、蘆丁、沒食子酸等［4］。桑葉中多酚因其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有活潑的羥基氧，能在多酚氧化酶作用下終止生物體內(nèi)自由基的連鎖反應(yīng)，起到清除自由基和消除自由基毒性的作用［5］，從而表現(xiàn)出抗氧化［6］、抗衰老［7］、防治腫瘤［8］及增加機(jī)體免疫力［9］等多種生物活性。但在桑葉飲料的工藝研制［10］和生產(chǎn)［11］中對(duì)桑葉茶的浸提工藝都是通過感官評(píng)價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化，有一定主觀性，缺乏準(zhǔn)確數(shù)據(jù)支撐，且沒有考慮到各個(gè)影響因素之間的交互性。

響應(yīng)面法是一種有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，該方法基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過建立數(shù)學(xué)模型來解決受多因素影響的最優(yōu)組合問題，可以在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合、預(yù)測(cè)響應(yīng)值，比一次次的單因素分析方法更有效［12］。

本研究針對(duì)桑葉茶中含量較為豐富的游離氨基酸和多酚兩種有益成分同步進(jìn)行提取工藝的研究，基于準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，通過響應(yīng)面法建立多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系［13］，充分考慮各因素之間的影響，從而得到兩種成分共同最優(yōu)的提取工藝，使得桑葉茶浸提后從口感和保健的價(jià)值上都可以達(dá)到較高的水平，為以后的桑葉茶飲料制取的浸提工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；桑葉茶（每100 g含有氨基酸總量約為17.249 g）江蘇緣生堂；水合茚三酮、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉等（均為分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

HC-400Y2粉碎機(jī)永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；SC-15水浴箱上海比朗儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司；TD12001分析天平奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

將實(shí)驗(yàn)用桑葉茶開封后即用高速粉碎機(jī)粉碎至70～300 目，之后混勻密封備用。

1.3.2游離氨基酸與多酚的提取

準(zhǔn)確稱取一定量桑葉茶粉末，加入100 mL去離子水配成一定水茶比的料液，在一定浸提溫度條件下浸提一定時(shí)間，浸提液冷卻后減壓過濾，將過濾后的浸提液定容至100 mL，并記錄濾液質(zhì)量。

1.3.3響應(yīng)面法優(yōu)化游離氨基酸與多酚的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸提溫度、水茶比和浸提時(shí)間3 個(gè)影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，桑葉茶試驗(yàn)因素與水平參見表1，有17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為析因點(diǎn)，5 個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)共試驗(yàn)了5 次，以估計(jì)誤差［14-18］。

表1　桑葉茶浸提試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.4桑葉茶主要成分的測(cè)定

多酚含量測(cè)定方法參見GB/T 21733—2008《茶飲料》；游離氨基酸含量測(cè)定方法參見GB/T 8314—2013《茶：游離氨基酸總量的測(cè)定》。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取250 mg谷氨酸純品溶于水中并定容至25 mL，分別移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL之后再分別加水定容至50 mL，分別吸取這5組谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別加入0.5 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL的2%茚三酮溶液，沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL，在579 nm波長處測(cè)其吸光度，用最小二乘法經(jīng)線性回歸后得到，相關(guān)系數(shù)R=0.999 8，式中：C為氨基酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；A為吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1浸提溫度對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響

圖 1　浸提溫度對(duì)桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

為考察浸提溫度對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響，分別在50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃條件下對(duì)桑葉茶進(jìn)行了浸提，由圖1可知，在水茶比90∶1（mL/g）、浸提時(shí)間20 min的條件下，游離氨基酸提取量在55～60 ℃有明顯的上升，之后隨著溫度上升呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的增長趨勢(shì)，并從80 ℃開始提取量基本保持穩(wěn)定；多酚提取量在70 ℃之前隨溫度升高緩慢增長，從70 ℃開始呈現(xiàn)明顯的增長，并在85 ℃開始，提取量基本保持穩(wěn)定。游離氨基酸分子質(zhì)量較小且含量更多，相比多酚更易溶出，而茶多酚主要分布在葉肉組織深層，穩(wěn)定性好，要較高的溫度才能溶出［19］，故溫度變化對(duì)其浸出的影響較大，這與先前學(xué)者的研究［20-21］一致。綜合考慮兩者的提取量，浸提溫度選擇85 ℃較為合適。

圖 2　水茶比對(duì)桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.2　Effect of ratio of tea to water on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

2.1.2水茶比對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響為考察水茶比對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響，分別對(duì)50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、

110∶1、130∶1、150∶1（mL/g）水茶比的桑葉茶進(jìn)行了浸提，如圖2所示，在浸提溫度85 ℃、浸提時(shí)間20 min

條件下，隨著水茶比的增大，游離氨基酸的提取量在

50∶1～90∶1之間增加速率較快，并從90∶1（mL/g）開始提取量基本保持穩(wěn)定；多酚提取量在水茶比50∶1～90∶1

范圍呈現(xiàn)增長，在90∶1之后提取量有些微小的上下浮動(dòng)，但提取量基本保持穩(wěn)定。隨水茶比的增加，桑葉中游離氨基酸和多酚提取量上升至最高值之后趨于穩(wěn)定，這是由于兩種成分浸出完全，增加溶劑并不能起到增加提取量的效果［22］。因此綜合兩種成分的提取量，水茶比選擇90∶1（mL/g）較為合適。

2.1.3浸提時(shí)間對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響

圖 3　浸提時(shí)間對(duì)桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

為考察浸提時(shí)間對(duì)游離氨基酸和多酚提取量的影響，本試驗(yàn)分別在對(duì)應(yīng)5、10、15、20、25、30、35、45、60 min浸提時(shí)間條件下的桑葉茶進(jìn)行了浸提，如圖3所示，在浸提溫度85 ℃、水茶比90∶1（mL/g）的條件下，隨著浸提時(shí)間的延長，桑葉中游離氨基酸提取量在5～15 min間有顯著的增加，15 min之后提取量基本保持穩(wěn)定；桑葉多酚提取量在10～15 min區(qū)間有顯著增加，15～20 min增加趨勢(shì)變緩，在20～45 min區(qū)間內(nèi)提取量基本保持穩(wěn)定，之后隨著浸提時(shí)間的延長又有了明顯的下降趨勢(shì)。這可能與浸提的原理有關(guān)，固-液浸提過程為3步：1）溶劑進(jìn)入固體內(nèi)部，溶質(zhì)溶解；2）溶質(zhì)從固體內(nèi)部到表面；3）溶質(zhì)溶解液從固體表面到溶劑中。游離氨基酸的分子質(zhì)量較小，較多酚而言能夠更快的溶出，超過一定的時(shí)間后，多酚溶出量開始上升，而游離氨基酸則大部分已溶出，延長時(shí)間也對(duì)游離氨基酸的溶出意義不大［23］。而多酚提取量隨浸提時(shí)間延長之后出現(xiàn)下降，是由于多酚已經(jīng)基本浸提完全，隨時(shí)間的延長引起降解、轉(zhuǎn)化或絡(luò)合［24-25］。因此綜合兩種成分的提取量，時(shí)間并不是越長越好，選用20 min作為桑葉茶的浸提時(shí)間較為合適。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2為Design-Expert中根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所給出的桑葉茶的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果。

表2　桑葉茶浸提試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到游離氨基酸和多酚提取量對(duì)浸提溫度（A）、水茶比（B）和浸提時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

游離氨基酸提取量/（mg/g）=－4.969 08+0.385 16A+ 0.195 81B－0.058 285C－1.14×10－3AB+6.675×10－4AC+ 5.362 5×10－4BC－1.568 5×10－3A2－5.583 75×10－4B2－1.331×10－3C2

多酚提取量/（mg/g）=－212.061 15+4.551 07A+ 0.339 23B+0.954 33C+7.687 5×10－4AB－7.017 5×10－3AC－1.818 75×10－3BC－0.025 338A2－1.898 31×10－3B2－6.373 25×10－3C2

表3　桑葉茶游離氨基酸浸提回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of free amino acids from mulberry leaf tea

表 4　桑葉茶多酚浸提回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of polyphenols from mulberry leaf

由表3、4可知，游離氨基酸浸提模型的P＜0.000 1，多酚浸提模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；游離氨基酸浸提失擬項(xiàng)P=0.109 5，不顯著，多酚浸提失擬項(xiàng)P=0.085 4，不顯著；游離氨基酸浸提復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.993 0，多酚浸提復(fù)相關(guān)系數(shù)R為0.994 6，說明桑葉茶這兩種有效成分的浸提模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型來分析和預(yù)測(cè)桑葉茶浸提的工藝結(jié)果。

表5　桑葉茶游離氨基酸浸提回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Taabbllee 55 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn eexxttrraaccttiioonn ooff ffrreeee aammiinnoo aacciiddss ffrroomm mmuullbbeerrrryy lleeaaff tteeaa

由表5回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，游離氨基酸模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)均顯著。表明各影響因素對(duì)于桑葉茶中浸游離氨基酸提取量的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

表6　桑葉茶多酚浸提回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果TTaabbllee 66 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn extraction of polyphenols from mulberry leaf tea

由表6回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，多酚模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均極顯著，交互項(xiàng)AC、BC顯著，AB不顯著。表明各影響因素對(duì)于桑葉茶中多酚提取量的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3桑葉茶浸提工藝的響應(yīng)面

當(dāng)浸提溫度為90 ℃時(shí)，由圖4可知，游離氨基酸提取量隨著水茶比的增加而增加，并在水茶比達(dá)到85∶1（mL/g）左右提取量基本保持穩(wěn)定，而隨著浸提時(shí)間的延長，游離氨基酸的提取量變化不明顯。隨著水茶比的增加，多酚提取量逐漸增加，并在水茶比達(dá)到82∶1左右提取量基本保持穩(wěn)定，隨著浸提時(shí)間的延長，多酚提取量有所增加之后又出現(xiàn)些微下降，且水茶比越高這種趨勢(shì)越明顯。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。從圖4等高線圖可以看出，水茶比相對(duì)于浸提時(shí)間對(duì)游離氨基酸提取量的影響作用更為顯著一些；對(duì)于多酚提取量則是在水茶比約82∶1之前，水茶比影響作用較浸提時(shí)間顯著，而在水茶比達(dá)到約82∶1之后，則浸提時(shí)間的影響更為顯著。

圖 4　桑葉茶浸提過程中水茶比和浸提時(shí)間交互作用對(duì)提取量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4　Response surface plot and contour plot showing the effect of ratio of water to tea and extraction time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

圖 5　桑葉茶浸提過程中浸提溫度和浸提時(shí)間交互作用對(duì)提取量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

當(dāng)水茶比為90∶1（mL/g）時(shí)，由圖5可知，隨著浸提溫度的上升，游離氨基酸的提取量也隨之升高，并在浸提溫度達(dá)到約85 ℃之后，游離氨基酸提取量基本保持穩(wěn)定，而隨著浸提時(shí)間的延長，桑葉茶中的游離氨基酸的提取量有些微增加但變化不明顯。隨著浸提溫度的升高，多酚提取量隨之增加，且在浸提溫度達(dá)到約80 ℃之后，隨著浸提時(shí)間的延長，多酚提取量都有所下降，隨著浸提溫度繼續(xù)升高，這種趨勢(shì)出現(xiàn)的時(shí)間越早且越明顯。從圖5等高線圖可以看出，浸提溫度對(duì)游離氨基酸提取量影響作用較浸提時(shí)間更為顯著；對(duì)于多酚提取量在浸提溫度約85 ℃之前，浸提溫度相對(duì)于浸提時(shí)間表現(xiàn)更為顯著一些，而在85 ℃之后，兩者對(duì)多酚提取量影響的交互性變得顯著。

圖 6　桑葉茶浸提過程中浸提溫度和水茶比交互作用對(duì)提取量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and ratio of water to tea and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

當(dāng)浸提時(shí)間為20 min時(shí)，由圖6可知，隨著浸提溫度和水茶比的升高和增加，游離氨基酸的提取量增加，隨之浸出完全提取量漸漸趨于穩(wěn)定。隨著浸提溫度升高多酚提取量增加，在浸提溫度達(dá)到約84 ℃，多酚提取量達(dá)到相對(duì)最大值并保持穩(wěn)定，至約93 ℃穩(wěn)定結(jié)束，提取量開始略有下降，而在浸提溫度84～93 ℃之間，隨著水茶比的增加，多酚提取量增加，其余溫度區(qū)間隨著水茶比的增加多酚提取量變化不明顯。由圖6等高線圖可知，浸提溫度和水茶比對(duì)游離氨基酸的提取量都有顯著的影響作用，交互作用明顯；對(duì)于多酚提取量，浸提溫度有著較為顯著的影響作用。

比較上面的3組圖可知，浸提溫度和水茶比對(duì)桑葉茶中的游離氨基酸提取量的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，浸提時(shí)間影響作用一般顯著，表現(xiàn)為曲線相對(duì)較平緩，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值的變化較小。浸提溫度對(duì)桑葉茶中的多酚提取量的影響最為顯著，其次是水茶比，浸提溫度次之。

根據(jù)軟件Design-Expert對(duì)桑葉茶中的游離氨基酸和多酚的模型進(jìn)行計(jì)算，將這兩個(gè)響應(yīng)值的重要性設(shè)定為同等重要，并考慮到不同條件下的能耗問題，選取模型中的最優(yōu)浸提條件，得出最佳浸提溫度88.62 ℃、水茶比86.83∶1（mL/g）、浸提時(shí)間16.06 min，在此條件下游離氨基酸提取量可達(dá)到21.28 mg/g，多酚提取量可達(dá)到14.48 mg/g。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化浸提條件對(duì)桑葉茶進(jìn)行浸提，考慮到實(shí)際操作的便利，將浸提工藝參數(shù)修正為：浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提時(shí)間16 min。在此條件下浸提3 次，實(shí)際測(cè)得游離氨基酸提取量為21.46 mg/g，多酚提取量為14.32 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相比，游離氨基酸的相對(duì)誤差為0.85%，茶多酚的誤差率為1.10%。因此，基于響應(yīng)面所得的優(yōu)化浸提工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié) 論

利用響應(yīng)面法，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到桑葉茶游離氨基酸和多酚與浸提溫度、水茶比、浸提時(shí)間關(guān)系的回歸模型，從模型的響應(yīng)面及其等高線對(duì)影響桑葉茶游離氨基酸和多酚提取量的3 個(gè)關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行了探討。并得出最佳條件為浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提時(shí)間16 min，該條件下得兩種成分的提取量分別是：游離氨基酸21.46 mg/g，多酚14.32 mg/g。

因此選取兩種主要成分作為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法對(duì)桑葉茶浸提工藝進(jìn)行研究優(yōu)化，充分考慮到不同操作條件之間的相互影響作用，以及使得不同成分提取量的最大化所對(duì)應(yīng)的操作條件的差異，建立合理有效的模型進(jìn)行系統(tǒng)的分析優(yōu)化，減少了針對(duì)單個(gè)因素分別實(shí)驗(yàn)的盲目性，從而在有效的模型中得到最優(yōu)浸提條件，并對(duì)模型得出的最優(yōu)條件下的預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，充分證明了模型結(jié)果的準(zhǔn)確性，為桑葉茶浸提工藝的研究提供了參考。

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Optimization of the Extraction Process of Free Amino Acids and Polyphenols from Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

WANG Xingtian， LI Guishui*， CHENG Lijun， LI Yi， TAO Siyi， ZHANG Bing
（Tianjin Key Laboratory of Integrated Design and On-line Monitoring for Light Industry and Food Machinery and Equipment，College of Mechanical Engineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin300222， China）

In order to achieve good taste and high nutritional value for mulberry leaf tea beverage， the extraction simultaneous process of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea using water as the extractant was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction temperature， water/tea ratio and extraction time were 89 ℃， 87:1 （mL/g）， and 16 min， respectively. Under these conditions， the extraction yields of free amino acids and polyphenosl were experimentally determined to be 21.46 and 14.32 mg/g， respectively， which were both close to the predicted values. These results indicate the quadratic polynomial mathematical model built by Design-Expert software was accurate and feasible and the optimized extraction process was stable and reliable. This study can provide a reference for the development of mulberry leaf tea beverage.

mulberry leaf tea； response surfa ce methodology （RSM）； polyphenols； free amino acids； extraction

TS272

A

1002-6630（2015）24-0083-06

10.7506/spkx1002-6630-201524014

2015-04-26

王星天（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉蔷喾蛛x。E-mail：wangxingtian525@126.com*

李桂水（1965—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)榉蔷喾蛛x。E-mail：liguishui@tust.edu.cn