陳薇薇，孫海艷*，蔣 赟，郝晨星，李曉林，郭啟高，何 橋，向素瓊，梁國魯*（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶　400716）

枇杷香氣成分固相微萃取條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

陳薇薇，孫海艷*，蔣 赟，郝晨星，李曉林，郭啟高，何 橋，向素瓊，梁國魯*
（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400716）

探討頂空固相微萃取采集枇杷香氣的最優(yōu)條件，以紅肉枇杷“金華1號”為材料，采用正交試驗(yàn)研究萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量和萃取頭類型4 個(gè)因素對枇杷香氣檢出峰數(shù)量和總峰面積的影響。以總峰面積為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，萃取條件最優(yōu)組合為萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間40 min、樣品量6 g和萃取頭類型85 μm PA，但檢出峰數(shù)偏低。以檢出峰數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，在保證檢出峰數(shù)差異不顯著的前提條件下，選取總峰面積大的萃取條件作為最優(yōu)組合，即萃取條件的最優(yōu)組合為萃取頭類型50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取時(shí)間20 min、萃取溫度50 ℃、樣品量5 g。本研究共檢測到8 類91 種香氣成分，其中醇類物質(zhì)占17.6%；醛類物質(zhì)占13.2%；酯類物質(zhì)占24.2%；烷烴類物質(zhì)占14.3% ；酮類占9.9%；烯烴類物質(zhì)占10.9%；酸類物質(zhì)占6.6%；其他類物質(zhì)3 種，占3.3%。

枇杷；固相微萃?。粌?yōu)化；香氣

枇杷為薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）枇杷屬（Eriobotry japonica）植物，主要分布在東亞、東南亞等熱帶亞熱帶地區(qū)［1］，是世界上重要的常綠果樹之一。我國主要分布在長江以南的浙江、安徽、江蘇和福建等省。枇杷成熟于初夏，果實(shí)甜酸適度，風(fēng)味獨(dú)特，肉質(zhì)細(xì)嫩，風(fēng)味鮮美，堪稱果中珍品，深受人們喜愛。隨著市場對果品品質(zhì)的要求越來越高，人們也越來越關(guān)注果實(shí)風(fēng)味。而枇杷果實(shí)中香氣物質(zhì)的種類和含量是構(gòu)成并影響其風(fēng)味品質(zhì)的重要因素之一。因此，香氣成分分析已成為枇杷果實(shí)成熟期品質(zhì)鑒別的重要研究內(nèi)容之一。樣品中香氣成分的提取是進(jìn)行分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已有研究提取揮發(fā)性成分多采用蒸汽蒸餾法［2-3］、有機(jī)溶劑萃取法［3-4］和動態(tài)頂空法［4-5］等。固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）法與傳統(tǒng)技術(shù)相比，適合萃取小分子質(zhì)量的揮發(fā)、半揮發(fā)性物質(zhì)，具有無需有機(jī)溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)［5-7］，并可以與氣相色譜（gas chromatography，GC）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［8］等技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行分離檢測，其中SPME-GC是研究最早、也是發(fā)展最成熟的一種聯(lián)用技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)研究領(lǐng)域［8-10］。如在油桃、杏、百香果、草莓、葡萄、楊梅等果實(shí)香氣物質(zhì)成分分析中已經(jīng)廣泛運(yùn)用［2，11-15］。SPME是采用針頭涂敷的吸附劑，對達(dá)到氣-液平衡的氣體化學(xué)成分進(jìn)行吸附，在GC高溫進(jìn)樣口解吸，通過質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析即可定性和定量。但在萃取過程中，萃取量、萃取頭類型、萃取溫度、萃取時(shí)間、加入的電解質(zhì)和pH值、試樣混合速率等都是影響萃取效果的重要因素［16-17］。然而，有關(guān)枇杷果實(shí)香氣固相微萃取條件的優(yōu)化鮮見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用多因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合評價(jià)固相微萃取過程中的溫度、時(shí)間、樣品量和萃取頭類型4 個(gè)因素對枇杷果肉香氣成分的檢出峰數(shù)和總峰面積的影響，篩選出最優(yōu)的萃取條件，為枇杷果實(shí)香氣組分的檢測及進(jìn)一步分析提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

以西南大學(xué)選育的2014年通過重慶市農(nóng)作物新品種鑒定的紅肉枇杷“金華1號”的成熟果實(shí)為材料。

1.2儀器與設(shè)備

QP2010型GC-MS聯(lián)用儀、AOC-5000自動進(jìn)樣裝置日本島津公司；3 種類型萃取頭（85 μm聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/ DVB）、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS））美國Supelco公司；頂空進(jìn)樣瓶（20 mL）中國安普公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

將保存的樣品用液氮研磨至粉末狀，取適量樣品于20 mL頂空萃取瓶，加入5 mL飽和氯化鈉溶液，置于自動萃取裝置的萃取盤，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.3.2GC-MS操作條件

GC條件：色譜柱：Rtx-5MS（30 m×0.25 μm，0.25 mm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持1 min，最后以5 ℃/min的速率升至240 ℃保持2 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min，恒線速率，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

MS條件：離子源為電子電離（electron ionization， EI）源，離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍m/z 35～350。

1.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取萃取過程中所涉及的4 個(gè)關(guān)鍵因素，包括萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量和萃取頭類型。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及前人單因素試驗(yàn)確定因素范圍［16-18］，并在每個(gè)因素內(nèi)設(shè)置3 個(gè)水平，以探尋最佳水平。試驗(yàn)共9 個(gè)處理，重復(fù)2 次，以檢出峰數(shù)和總峰面積為評價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素及水平Taabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy eexxppeerriimmeennttss

1.3.4定性與定量分析

SPME采用自動進(jìn)樣裝置，枇杷香氣成分分析采用GC-MS聯(lián)用儀。數(shù)據(jù)分析運(yùn)用計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫（NIST 08）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，確認(rèn)香氣物質(zhì)的化學(xué)成分，按峰面積歸一化法算出樣品各個(gè)組分的相對含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果按有重復(fù)無交互作用資料做方差分析，檢驗(yàn)各因素對檢出峰數(shù)和檢出峰面積的影響。所有計(jì)算通過DPS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)9.50完成。

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

2　結(jié)果與分析

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Taabbllee 22 　RReessuullttss aanndd aannaallyyssiiss ooff oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy eexxppeerriimmeennttss

表3　色譜峰總峰面積方差分析Taabbllee 33 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ooff tthhee ttoottaall aarreeaass ooff GGCC ppeeaakkss

表 4　不同類型萃取頭對總峰面積的多重比較TTaabbllee 44 　MMuullttiippllee ccoommppaarriissoonn ooff ppeeaakk aarreeaa aammoonngg ddiiffffeerreenntt ttyyppeess ooff extraction fi bbeerr

如表2所示，比較總峰面積極差（R）值得知，因素效應(yīng)順序?yàn)椋狠腿☆^類型＞萃取溫度＞萃取時(shí)間＞樣品量，其中，85 μm PA檢出峰總峰面積高于其他2種萃取頭。對表2作方差分析，由表3可知，4 個(gè)因素中除不同萃取頭類型間差異達(dá)極顯著外，萃取溫度、萃取時(shí)間和樣品量間差異均不顯著。不同萃取頭類型的多重比較結(jié)果（表4）表明，85 μm PA和50/30 μm DVB/CAR/PDMS間差異顯著，但兩者與65 μm PDMS/DVB間差異達(dá)極顯著。不同處理間總峰面積的比較結(jié)果顯示（表2），3號處理總峰面積最大，除與1號處理間差異不顯著外，與其他7個(gè)處理均差異顯著。使用65 μm PDMS/DVB萃取頭的4、5、6號處理總峰面積普遍偏低，與另外2種萃取頭類型的處理間差異顯著。由此可得檢出峰總峰面積的最優(yōu)萃取條件組合為萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間40 min、樣品量6 g、萃取頭類型85 μm PA，即試驗(yàn)中的3號處理，2個(gè)重復(fù)峰面積總和為7.571×108。

表5　色譜檢出峰數(shù)方差分析Taabbllee 55 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ooff tthhee ttoottaall nnuummbbeerr ooff GGCC ppeeaakkss

表6　不同類型萃取頭對檢出峰數(shù)的多重比較TTaabbllee 66 　MMuullttiippllee ccoommppaarriissoonn ooff ppeeaakk nnuummbbeerr aammoonngg ddiiffffeerreenntt ttyyppeess ooff extraction fi bbeerr

對檢出峰數(shù)影響最大的因素仍為萃取頭類型，且遠(yuǎn)高于萃取溫度、萃取時(shí)間和樣品量。各處理檢出峰數(shù)的方差分析結(jié)果（表5）表明，萃取頭類型對檢出峰數(shù)有極顯著影響（P＜0.01），而萃取時(shí)間、萃取溫度和樣品量影響不顯著。對萃取頭類型進(jìn)一步多重比較，結(jié)果（表

6和表2）表明，采用65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭的處理出峰數(shù)差異不顯著，但都顯著高于使用85 μm PA萃取頭的處理組合。

2.2 枇杷香氣成分分析

表7　9 種正交試驗(yàn)組合枇杷香氣成分及其相對含量TTaabbllee 77 　AArroommaa ccoommppoonneennttss aanndd rreellaattiivvee ccoonntteennttss iinn llooqquuaatt ffrroomm nniinnee orthogonal array ruunnss

續(xù)表7

續(xù)表7

由表7可知，9種處理檢測出匹配度大于85%的香氣成分共8 類91 種，其中醇類物質(zhì)16 種，占17.6%；醛類物質(zhì)12 種，占13.2%；酯類物質(zhì)22 種，占24.2%；烷烴類物質(zhì)13 種，占14.3%；酮類9 種，占9.9%；烯烴類物質(zhì)10 種，占10.9%；酸類物質(zhì)6 種，占6.6%；其他類物質(zhì)3 種，占3.3%。本研究中相對含量較高的為醛類和酯類類物質(zhì)，醛類主要為C6～C15的醛類物質(zhì)，其中C8～C13的中級醛具有果香味，C6醛則是具有“青香型”的香氣物質(zhì)［19］；同時(shí)，酯類物質(zhì)一般也具有使人愉快的水果香氣［20］。9 種處理香氣成分，僅有兩種共有成分癸醛和（E）-壬烯醛，處理4和處理5兩者的相對含量均在1%以上。

3　討論與結(jié)論

與單因素試驗(yàn)相比，正交試驗(yàn)具有工作量小、數(shù)據(jù)分析簡便直觀、獲得信息豐富等特點(diǎn)，在化學(xué)分析條件的優(yōu)化中應(yīng)用價(jià)值很高［21］。本研究從3 個(gè)不同水平上系統(tǒng)比較了萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量和萃取頭類型4 個(gè)因素對枇杷香氣成分分析中總峰面積和檢出峰數(shù)量的影響，對SPME條件進(jìn)行了優(yōu)化。綜合本研究的分析結(jié)果，萃取頭類型對總峰面積和檢出峰數(shù)有極顯著的影響。以總峰面積為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)萃取條件組合（3號處理）的總峰數(shù)則偏低。以檢出峰數(shù)為指標(biāo)評價(jià)時(shí)，由表2可知，處理4～9號的出峰總數(shù)較高，但差異不顯著，在保證檢出峰數(shù)差異不顯著的前提下，選取總峰面積大的萃取條件（7號處理）作為最優(yōu)萃取條件組合，即萃取頭類型50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取時(shí)間20 min、萃取溫度50 ℃、樣品量5 g。

本研究香氣成分分析結(jié)果共有8 類91 種，其中醇類物質(zhì)16 種，占17.6%；醛類物質(zhì)12種，占13.2%；酯類物質(zhì)22 種，占24.2%；烷烴類物質(zhì)13 種，占14.3%；酮類9 種，占9.9%；烯烴類物質(zhì)10 種，占10.9%；酸類物質(zhì)6 種，占6.6%；其他類物質(zhì)3種，占3.3%。在所檢測到的91種物質(zhì)中，相對含量較高的的為酯類和醛類物質(zhì)，同時(shí)酯類物質(zhì)和醛類物質(zhì)的閾值很低，低達(dá)10－9級別［22］，由此可見，酯類和醛類物質(zhì)為枇杷的主要香氣成分。此外，盡管醇類物質(zhì)的相對含量較低，但其閾值通常較高為10－6級別［22］，因此，醇類物質(zhì)是否為枇杷的主要香氣成分有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中酮類和烯烴類物質(zhì)的相對含量較低，但其閾值也較低，大部分為10－9級別［23-27］，比如具有紫羅蘭花香的β-紫羅蘭酮香氣閾值為7 μg/L［28］，α-蒎烯香氣閾值為4.6 μg/L［23］，因此，酮類和烯烴類也為枇杷主要的香氣成分。與其他枇杷香氣成分研究相比，付婷婷［29］對大五星枇杷的香氣成分分析研究中共檢測到6 類116 種香氣成分，含量最高的的為酯類物質(zhì)，其次為醚類和醇類物質(zhì)，而本研究中，僅檢測到1 種醚類物質(zhì)，且相對含量在0.525%～0.97%之間；在付婷婷的研究中還檢測到烷烴類物質(zhì)的種類和含量也很高，但該研究認(rèn)為烷烴類物質(zhì)不構(gòu)成果實(shí)的香氣成分，未在文中列出。蔣際謀等［30］對香鐘枇杷和解放鐘枇杷及兩者雜交子代優(yōu)系果實(shí)的香氣成分分析研究中共檢測到了11 類91 種香氣成分，含量最高的為萜類物質(zhì)中的D-檸檬烯（62.59%～68.32%），其次為醛類物質(zhì)；而本研究中萜類物質(zhì)的含量則較低（0.5%～5.65%）。此外，Chen Faxing等［31］的研究報(bào)道了酮、酸、酸、烷類為“早鐘6號”中含量最高的香氣成分。本研究與其他研究的差異可能與選用的品種、栽培條件等有關(guān)，同時(shí)也表明了枇杷果肉具有豐富的香氣成分。

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Orthogonal Array Optimization of Solid Phase Micro-Extraction Conditions for Loquat Aroma Compounds

CHEN Weiwei， SUN Haiyan*， JIANG Yun， HAO Chenxing， LI Xiaolin， GUO Qigao， HE Qiao， XIANG Suqiong， LIANG Guolu* （College of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing400716， China）

This study aimed to explore the optimal conditions of head space solid phase micro-extraction （HS-SPME） for the analysis of aroma compounds in “Jinhua 1” red-fl eshed loquats. An orthogonal array design was applied to establish the optimum conditions of extraction temperature， extraction time， sample weight and fi ber. The results showed that based on peak area， the optimal conditions were determined as follows: 6 g of sample was extracted at 50 ℃ for 40 min using an 85 μm PA fi ber， under which， however， a smaller number of peaks were separated， while those determined based on the total number of peaks without producing signifi cant differences in this parameter were determined as follows: 5 g of sample was extracted at 50 ℃ for 20 min using a 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber. A total of 91 aroma components were identifi ed in loquat， which belonged to eight chemical classes including alcohols （17.6%）， aldehyde （13.2%）， esters （24.2%）， alkane （14.3%）， ketone （9.9%）， olefi ns （10.9%）， acids （6.6%） and three other substances （3.3%）.

loquat； headspa ce-solid-phase micro extraction （HS-SPME）； optimization； aroma

S667.3

A

1002-6630（2015）24-0035-05

10.7506/spkx1002-6630-201524006

2015-05-26

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD02B02）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2014D046；XDJK2015C054）；西南大學(xué)本科生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（1319001）

陳薇薇（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡溥z傳育種與生物技術(shù)。E-mail：253482217@qq.com

孫海艷（1975—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)楣麡溥z傳育種與生物技術(shù)。

E-mail：sunhaiyan1975@126.com

梁國魯（1960—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)楣麡溥z傳育種與生物技術(shù)。E-mail：lianggl@swu.edu.cn