吳興泉，劉楷影，王貝貝，朱立娜，谷克仁

（河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

植物油脂具有豐富的多不飽和脂肪酸、維生素E、甾醇等成分，這些成分在一定程度上能夠很好地幫助預防冠心病、癌癥、高血壓、抑郁癥等疾病[1]，具有良好的食用價值和藥用價值，此外，植物油脂在化學分析、藥品研發(fā)、化妝品合成等方面也具有很高的應用價值[2].

目前，我國植物油脂產(chǎn)品良莠不齊，摻偽摻假現(xiàn)象時有發(fā)生，植物油脂的摻假現(xiàn)象主要有以下兩個方面，一是摻入低價位植物油，二是標識混亂.例如，在植物油脂產(chǎn)品的地理產(chǎn)地、品種來源、制作方法、轉(zhuǎn)基因成分等方面進行欺騙性標識.其中摻入低價位植物油造成的摻假現(xiàn)象最為普遍，比如，在橄欖油中摻入榛子油、扁桃仁油、玉米油、棕櫚油、葵花籽油[3]、大豆油、花生油、棉籽油等[4].盡管絕大多數(shù)的摻假情況不會對人們健康造成巨大威脅（例如低級橄欖油摻入高級橄欖油），但是個別油料作物的過敏原蛋白還是會對敏感人群造成威脅[5].摻雜現(xiàn)象也會給制造商帶來不公平競爭，使消費者不能做出公正抉擇.因此建立植物油脂的檢測監(jiān)控、追蹤溯源技術(shù)可有效保護消費者和生產(chǎn)者的利益，防止摻偽摻假現(xiàn)象的發(fā)生.

過去的幾年時間里，許多不同的分析方法用于食品溯源，主要包括3 大類，即色譜分析、光譜分析、DNA 為靶標分子的生物學分析[6-9].其中DNA 為靶標分子的分析方法具有很多優(yōu)點，例如靶標分子DNA 耐保存、普遍存在，核酸序列穩(wěn)定（不會隨著種植環(huán)境的改變而改變）等.DNA 為靶標的植物油脂檢測技術(shù)主要包括：常規(guī)聚合酶鏈式反應（PCR）、多重PCR、PCR-毛細管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測（PCR-CE-SSCP）、PCR-高分辨率溶解曲線（PCR-HRM）[10-11]、核酸序列測定等技術(shù)，可以檢測植物油脂的油料種類及同種油料的不同品種，以及是否為轉(zhuǎn)基因油脂等.作者總結(jié)了以DNA 為靶標的植物油脂檢測技術(shù)中涉及到的DNA提取方法、植物油脂的油料種類鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定以及油料品種溯源等技術(shù).

1 影響植物油DNA 提取及其檢測效果的因素

1.1 植物油脂精煉工藝影響DNA 的含量及完整性

水溶性的DNA 在植物油中的含量很少.植物油精煉過程對DNA 的破壞導致DNA 的含量較低、完整性較差.在隨后的儲藏過程中，DNA 含量以及完整性會進一步遭到破壞.盡管壓榨型植物油（橄欖油、花生油、芝麻油等）中的DNA 含量相對較高，但總體含量仍然很低，因此植物油脂中DNA 的高效提取成為應用以DNA 為靶標進行油脂檢測技術(shù)的關(guān)鍵.一般增大待測植物油的用量、在DNA 提取之前增設(shè)富集過程等均可增加DNA 提取成功率[12].

1.2 植物油脂的儲存時間

隨著植物油儲存時間的延長，空氣氧化作用和核酸酶酶解作用都會破壞DNA 的含量以及完整性.為了獲得良好的檢測效果，待測的植物油越新鮮越好.Pafundo 等[13]依據(jù)儲藏時間（1 周、3 周、6個月、9 個月、一年、二年）的不同，通過毛細管電泳形象地將植物油及相應葉片中DNA 的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)儲藏時間為6 個月、9 個月、一年、二年時，兩者在DNA 片段數(shù)量和大小方面都有明顯不同.當植物油為新獲得樣品時，可以獲得很好的重復性.

1.3 DNA 的提取方法

現(xiàn)已報道的植物油脂DNA 提取方法有CTAB法、SDS 法和多種DNA 提取試劑盒法等.其中CTAB 法是傳統(tǒng)的提取方法，不斷有針對CTAB 法改進修飾方法的產(chǎn)生，比如：CTAB-己烷法、CTAB-己烷-氯仿法等[14].上述方法各有優(yōu)缺點[15]，目前雖然已有很多DNA 的提取方法嘗試用于植物油中DNA 的提取，但是或多或少會有PCR 抑制物殘留，比如多糖、蛋白、酚等，因此在DNA 提取后，需要采用專門的DNA 純化試劑盒去除PCR 抑制物.

1.4 PCR 擴增目標DNA 片段的大小

經(jīng)過化學精煉過程的植物油，其含有的DNA完整性不強，后期PCR 檢測時如果擴增片段較大往往會擴增失敗.Costa 等[16]以大豆種屬特異性基因Lectin 基因為靶標進行PCR 擴增，發(fā)現(xiàn)GM03/GM04 引物（118 bp）在脫膠植物油中擴增失敗，而LE1/LE2 引物（103 bp）卻有很好的擴增效果.采用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）法檢測橄欖油時，儲存10 d 和20 d 的樣本，擴增片段大小分別低于691 bp 和415 bp，而107 bp 的擴增產(chǎn)物沒有改變[13].如果采用SYBR qPCR 則擴增80 bp DNA 片段的效果明顯好于擴增200 bp 的DNA 片段.可見，針對油脂DNA 進行分子標記分析，使用較小片段作為靶標更具優(yōu)勢[17].

2 以DNA 為靶標的植物油脂檢測技術(shù)的應用

2.1 植物油摻假檢測與鑒定

我國植物油脂市場中油脂品種很多，因營養(yǎng)價值不同價格差異很大，將低價位油脂摻入高價位油脂中的現(xiàn)象很普遍.如果能有效地檢測出混合油脂中的各種組分即可實現(xiàn)摻假油的鑒定.不同物種具有各自不同的基因序列（即DNA 序列），這種差異在物種間穩(wěn)定存在，不會因種植地域和環(huán)境條件的改變而受到影響，因此利用DNA為靶標進行植物油摻偽檢測將具有很大的應用潛力.

2.1.1 鑒定方法

以DNA 為靶標的摻假油脂的鑒定主要采用PCR 法擴增各個油料作物的特定基因片段（靶基因序列），然后采用凝膠電泳、毛細管電泳等對擴增產(chǎn)物進行檢測[18-20].由于油料作物指紋圖譜與對應植物油指紋圖譜的一致性以及種內(nèi)保守性，在進行植物油摻假檢測時，可以依據(jù)指紋圖譜對應不同的油料作物以證實“摻假”情況.如果采用熒光定量PCR(qPCR)[18]技術(shù)則需要依據(jù)擴增曲線“產(chǎn)生與否”為標準進行判斷.

2.1.2 應用實例

楊冬燕等[4]分別以2∶1、1∶1、1∶1∶1 的比例將一種或兩種低價位油脂摻入一種高價位油脂中，以低價位油脂對應的油料作物種屬特異性基因為靶標，通過普通PCR 及雙重PCR 擴增后的電泳圖定性檢測摻偽現(xiàn)象.實驗結(jié)果表明，低價位油脂摻入量的多少直接影響著檢出率，以2∶1 比例摻偽的檢出率最高.Spaniolas 等[19]、張海亮[20]分別依據(jù)葉綠體trnL 內(nèi)含子區(qū)域、rbcL 基因序列設(shè)計通用引物，利用這些通用引物擴增常見油料作物靶基因，比如大豆、橄欖、芝麻、花生、玉米、葵花、菜籽、榛子、棉籽、鱷梨等，毛細管電泳結(jié)果顯示，依據(jù)指紋圖譜能夠?qū)⒔^大多數(shù)參試品種區(qū)分開.在區(qū)分鱷梨、芝麻與橄欖時，由于擴增片段長度相近，存在區(qū)分困難的情況，但借助SNP 位點設(shè)計引物，即可達到完全區(qū)分的效果.

2.1.3 靶基因的選擇

一般采用種屬特異性基因作為靶基因，需要滿足兩個條件：（1）該物種油料作物的所有品種均含有該基因；（2）其他物種油料作物不含有該基因或者說不存在該基因的靶序列.例如花生種屬特異性基因有幾丁質(zhì)酶chi2.2 基因[21]、過敏原基因Arah1、Arah2、Arah3 等；大豆種屬特異性基因有l(wèi)ectin 基因；油菜種屬特異性基因有PEP 基因、HMG I/Y 基因；玉米種屬特異性基因有zSSⅡb 基因、ivrl 基因等.油料作物種屬特異性基因，還可以選擇葉綠體基因，因為這些基因序列中部分序列在同一物種內(nèi)進化速度緩慢，比較保守，但是在不同物種間進化速度較快，具有較高的種間差異性，可以用于不同物種的鑒定.

2.2 轉(zhuǎn)基因油脂的檢測

轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因油菜等油料作物因具有高油脂、抗蟲、抗除草劑等特性[22]而被廣泛種植，并大量用于榨油行業(yè).為了保護消費者的知情權(quán)，有關(guān)組織頒布條例要求轉(zhuǎn)基因食品必須予以聲明.過去幾年，很多學者基于植物油精煉后，DNA 檢測不到或者檢測到的含量微小，錯誤地認為即使植物油中含有轉(zhuǎn)基因原料也不必標識.然而近幾年，隨著精煉植物油DNA 提取技術(shù)的成熟，DNA 提取質(zhì)量有了很大提升，轉(zhuǎn)基因檢測也成為必不可少的部分.Costa 等[16]沿著原材料準備、植物油提取、后期精煉等過程對轉(zhuǎn)基因大豆進行檢測，發(fā)現(xiàn)大豆內(nèi)標基因在所有過程樣品中（包括精煉過程每個步驟）都能檢測到，轉(zhuǎn)基因成分在原油以及最終的精煉油中同樣能檢測到.

在轉(zhuǎn)基因大豆油檢測中，lectin 基因經(jīng)常作為內(nèi)源基因，抗除草劑基因EPSPS 作為外源基因.在進行外源基因檢測之前，可結(jié)合轉(zhuǎn)基因作物的基因圖譜對調(diào)控基因（35 s 啟動子基因以及T-nos 終止子基因）進行檢測，此步驟被越來越多的學者認為是重要初篩步驟[23-24].

轉(zhuǎn)基因玉米的種類很多，比如Bt11、MON863、MON810、Bt176、T25、GA21、TC1507 等，其中由孟山都公司研制的轉(zhuǎn)基因玉米MON863，被作為主要的轉(zhuǎn)基因玉米得以種植，其插入的Cry3Bb1 殺蟲基因能夠編碼出來殺蟲蛋白Cry3Bb1，該基因的檢測結(jié)果可以作為植物油原料是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863 的判定標準.如今，植物油轉(zhuǎn)基因原料檢測、物種鑒定等不再是學者們研究的難點.

2.3 油脂的追蹤溯源技術(shù)

在植物油油料品種溯源鑒定中研究最多的是高價位橄欖油.對于特級初榨橄欖油而言，其原料品種很大程度上決定了油品質(zhì)量.由于橄欖的品種繁多[25]，橄欖油制備也從單一品種橄欖油向多品種橄欖油轉(zhuǎn)變.為了對橄欖油品種進行規(guī)范，也為了使具有優(yōu)良性狀的品種得以延續(xù)和保護，歐盟相關(guān)組織對特定的橄欖油品種頒布了“原產(chǎn)地標識PDO”和“地理標識PGI”.只有具有“PDO”和“PGI”標識的橄欖油品種才能用于制備橄欖油，對不具備保護標識的橄欖油要進行品種溯源鑒定.

在橄欖油品種溯源鑒定中應用最多是DNA 標記技術(shù)，主要有：AFLP、隨機擴增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNAs，RAPDs)、微衛(wèi)星序列（microsatellites，SSRs）、單核苷酸多態(tài)性 (singlenucleotide polymorphisms，SNPs)等.

2.3.1 AFLP 技術(shù)的應用

利用AFLP 技術(shù)不需要預先知道待擴增基因的序列，可以實現(xiàn)對多個基因位點同時擴增，進而可以在一個反應體系中擴增出來許多多態(tài)性條帶.Busconi 等[26]對Moraiolo、Taggiasca 兩個橄欖品種的葉片和橄欖油中的DNA 進行AFLP 分析，毛細管電泳檢測證實，如果橄欖葉片與橄欖油來自不同品種，擴增產(chǎn)物的檢測信號峰差別明顯；如果兩者為同一品種，則擴增產(chǎn)物的檢測信號峰具有高度一致性.Pafundo 等[27]進一步利用AFLP 結(jié)合毛細管電泳對橄欖葉子以及橄欖油進行分析時，發(fā)現(xiàn)兩者 AFLP 結(jié)果的一致性可以達到 70% .Montemurro 等[28]以10 個品種橄欖油為樣品，從6個AFLP 引物組合中篩選出來多態(tài)性指數(shù)（DI 值）最大的引物組合Pst-AGG/Mse-AGG，利用該引物組合擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果繪制系統(tǒng)進化樹，能夠?qū)⒃嚨乃衅贩N橄欖油區(qū)分開.分析發(fā)現(xiàn)葉子比油的擴增條帶多是因為葉子中DNA 遭到破壞的程度小，大于350 bp 的片段可以擴增.

2.3.2 RAPD 技術(shù)的應用

RAPD 的特點在于操作簡單、成本低、樣品需求量低等.Mohammad 等[29]使用15 個RAPD 引物對13 個約旦橄欖品種進行擴增，擴增得到156 個條帶，其中多態(tài)性條帶的比率為55%，多態(tài)性條帶中包含8 個品種特異性條帶.例如引物OPOX03-250 針對橄欖品種Souri 擴增出來特異性條帶，該引物可以作為鑒定該品種的特異性引物，也可以使用該引物對該品種橄欖壓榨的橄欖油進行鑒定.

2.3.3 SSR 技術(shù)的應用

SSR 的特點在于具有高度的多態(tài)性.Rotondi等[30]利用13 個SSR 引物對13 個橄欖品種進行擴增，共得到72 個等位基因，其中引物DCA9 擴增的等位基因數(shù)多達9 個.也可以從SSR 引物中篩選出針對特定品種的引物，用于橄欖油品種鑒定.Pasqualone 等[31]使用橄欖Leucocarpa 品種的單一特異性SSR 引物GAPU103A 將Leucocarpa 橄欖油與參試的其他6 個單一品種的橄欖油完全區(qū)分開.其中GAPU103A 引物的PD 值較高，在Vittorio Alba等[32]實驗中也得到證實，同時后者篩選出來另一個多態(tài)性引物UD043A，其單獨使用同樣能夠?qū)⒃嚨? 個PDO 品種橄欖油區(qū)分開.

SSR 分析中不可避免地會遇到橄欖葉子和橄欖油DNA 擴增結(jié)果不一致的部分，Doveri 等[33]結(jié)合凝膠電泳對葉子、果肉、胚芽、油等部位的DNA擴增結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)額外片段存在油、胚芽中，究其原因在于胚芽基因的混入，類似的結(jié)果在Rayda 等[34-35]毛細管電泳分析中也得到證實.鑒于胚芽基因可能會混入油脂中，在利用葉子DNA 擴增結(jié)果鑒定油脂品種時，需要適當注意排除胚芽基因的干擾.

2.3.4 SNP 技術(shù)的應用

SNP 的特點在于普遍性、穩(wěn)定性，能夠?qū)⒒虿顒e很小的品種區(qū)分開.Consolandi 等[36]利用多重PCR 結(jié)合LDR-UA 對含有17 個SNP 位點的基因序列進行擴增，利用擴增結(jié)果可區(qū)分8 個品種的橄欖油.

3 結(jié)論與展望

分析結(jié)果表明，以DNA 為靶標的植物油檢測技術(shù)已在植物油摻假檢測、轉(zhuǎn)基因植物油脂檢測、植物油油料品種追溯等方面取得了很好的應用效果.目前，植物油脂中的DNA 提取方法已經(jīng)成熟，鑒于DNA 分子穩(wěn)定性高、不易受到環(huán)境中各種不利因素影響等優(yōu)勢，以DNA 為靶標的植物油檢測技術(shù)具有很好的應用前景.

在植物油脂摻假鑒定技術(shù)中，目前主要是以不同油料作物的種屬特異性基因為靶標進行PCR擴增，然后結(jié)合凝膠電泳、毛細管電泳、熒光定量分析等手段進行定性檢測.轉(zhuǎn)基因原料摻入檢測涉及到內(nèi)源基因檢測、調(diào)控基因檢測、外源基因檢測，其中外源基因的檢測是轉(zhuǎn)基因檢測的核心.植物油的品種追溯主要是利用同一種油料不同品種間的特征性分子標記進行鑒定.目前應用的領(lǐng)域主要是橄欖油的分析，已經(jīng)取得了良好的應用效果.但在其他油脂的品種追蹤溯源方面尚未見到相關(guān)報道，這應該是今后植物油脂檢測鑒定技術(shù)的一個發(fā)展方向.

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