沈萬芳

(安徽省黃山風景區(qū)管委會園林局，安徽黃山 245800)

植物根際是受植物活根影響的土壤微區(qū)，是土壤微生物活動的重要場所之一［1－2］。在植物根際聚居著數(shù)量巨大、種類繁多的微生物，主要包括細菌、放線菌、真菌、線蟲和原生動物等，但這些微生物在環(huán)境中的功能目前仍了解很少，大部分根際過程的微生物學機理尚不清楚。目前植物根際微生物的研究重點多放在細菌上，對根際真菌的研究較少。昆蟲病原真菌廣泛分布于不同的生態(tài)環(huán)境中，不但可以寄生昆蟲，而且也能在不同的生境中營腐生生活，并且具有豐富的遺傳異質性［3］。目前已有昆蟲病原真菌在植物根際和根內定殖的研究報道。例如，綠僵菌可以在土壤中兼性腐生，維持其種群數(shù)量，從而起到持續(xù)防控害蟲的作用，且植物根圍和根際土壤中宿存動態(tài)的變化是有差異的［4－5］。Liao等［6］研究了羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii)作為根際微生物促進了植物對氮的吸收并增強了植物抗病性。且有研究認為昆蟲病原真菌在植物根際定殖不是隨機的，是有嚴格的相關性［7］。

昆蟲病原真菌殺蟲劑已被廣泛應用于農林業(yè)害蟲防治，如祝明亮等［8］研究了淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)在烤煙根際的定殖情況，發(fā)現(xiàn)如淡紫擬青霉是習居土壤的機會真菌，對根結線蟲(Meloidogyne spp.)和胞囊線蟲(Heterodera spp.)的卵有很強的寄生能力。根際昆蟲病原真菌除了可以實現(xiàn)地下害蟲生物防治以外，也有不少關于根際昆蟲病原真菌防治植物病害報道，如Renwick等［9］通過室內生測和小麥盆栽試驗發(fā)現(xiàn)分離自小麥根際的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)能有效持續(xù)控制小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis)。有些昆蟲病原真菌定殖植物根際后具有促進植物生長等特殊功能，如Liao等［8］報道羅伯茨綠僵菌寄生昆蟲后，可將從昆蟲中吸收的氮營養(yǎng)物質傳給植物，還可分泌各種有機酸溶解土壤中的固態(tài)磷和二氧化碳［10］，且可以消除土壤中的鉛污染，并能幫助植物吸收土壤中的鐵和鋅［11］。但昆蟲病原真菌用于生物防治往往受到防效不穩(wěn)定的困擾，其原因不僅是因為野外環(huán)境條件復雜，可能還與生防菌株在環(huán)境中包括土壤中存活的動態(tài)變化、與寄主植物之間的存活關系不明有關。作為生防因子的生防菌株能否在靶植物根際定殖生長及其對植株根際土壤微生物區(qū)系的抑制作用的強弱已成為篩選、評定土壤害蟲生防菌株的一個重要指標［8］。研究昆蟲病原菌與植物的相關性及在植物根際定殖情況，不僅具有重要的理論意義，而且對于保護和促進病原真菌在植物根際中的自我維持、更合理地利用真菌控制農林業(yè)地下害蟲也有重要的實踐意義。為此，筆者研究了安徽省六安市馬鬃嶺自然保護區(qū)春季不同植物根際昆蟲病原真菌的物種多樣性及分布情況，旨在為昆蟲病原真菌殺蟲劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基:馬鈴薯200.00 g(削皮切碎后煮沸20 min 左右，過濾)、葡萄糖 20.00 g、放線菌酮 0.20 g、氯霉素0.20 g、多果定0.50 g、結晶紫0.01 g、瓊脂20.00 g，水1 000.00 g。SDAY 培養(yǎng)基:葡萄糖 20.00 g、蛋白胨 10.00 g、酵母浸出粉 10.00 g、瓊脂 20.00 g，水 1 000.00 g。

1.2 試驗地概況 馬鬃嶺位于安徽省六安市金寨縣南部，境內總面積為4 843.33 hm2。該地區(qū)氣候溫和，雨量充沛，日照充足，無霜期長，自然條件優(yōu)越，植被資源極其豐富，是一座原始、古老、完美的綠色寶庫。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集。于2015年3月選取健康、生長較旺盛的植株，去除根系表層土壤和雜物。采集草本植物根際土壤時將其整個植株連根挖出，去除根上附著的大土塊，用毛刷將根上粘著的細土抖落，然后將植物根放入無菌袋，封口，貼上標簽。灌木或喬木采用鏟子采集植物根系(須根)，抖落大塊土壤，收集根系帶回實驗室置于4℃冰箱保存，共采集植物根系樣品20份。其中，草本植物含有細葉麥冬、野薔薇、紫背天葵、云臺南星、鐵線蕨、早熟禾、蛇莓、白葉莓、虎耳草、大薊、腎蕨、箬竹、絡石、常春藤、天葵;灌木含有胡頹子、中華石楠、山胡椒、茶樹;喬木有杉木。

1.3.2 植物根際真菌的分離和培養(yǎng)。①依次稱取每種植物的根系1.00 g，用無菌水沖洗植物根系去除表面大顆土粒，緊貼在根系的土壤可保留;②將清洗干凈的植物根系剪成0.5 cm的小段，放入100 ml雙蒸水中振蕩搖勻;③取100 μl溶液接種于選擇性培養(yǎng)基上，每個植物根系重復3次;④將接種的平皿置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d左右，檢查培養(yǎng)皿中菌落生長情況。根據(jù)培養(yǎng)皿內菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長速度等特點從每個樣品中盡可能多地挑選單菌落，轉入SDAY培養(yǎng)基劃線，純化，保存。

1.3.3 植物根際真菌的鑒定。對分離純化的菌株培養(yǎng)6～12 d后，依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和培養(yǎng)特征對菌落進行歸類并統(tǒng)計數(shù)量，在光學顯微鏡下進行顯微形態(tài)觀察，記載菌絲、孢子、產孢結構等形態(tài)特征，參照相關真菌分類文獻［12］進行真菌形態(tài)鑒定，明確其分類地位，并用顯微攝像儀拍照已鑒定的真菌形態(tài)。對于形態(tài)鑒定困難的菌株，需借助分子生物學手段進一步鑒定。

1.3.4 植物根際真菌菌落的計數(shù)。培養(yǎng)規(guī)定天數(shù)后，采用稀釋平板法統(tǒng)計菌落數(shù)量。雖然該研究采用的是針對分離培養(yǎng)昆蟲病原真菌的選擇性培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基也不能滿足所有昆蟲病原真菌的生長需求，所以得到的數(shù)據(jù)不能完全準確地表現(xiàn)出土壤中昆蟲病原真菌的實際數(shù)量，但是可以作為相對數(shù)值來反映根際昆蟲病原真菌的數(shù)量及其分布規(guī)律［13］。

每克根系中菌落數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/根系質量(g)1.3.5 菌種的保存。將純化培養(yǎng)的真菌接種到滅菌的甘油水溶液(甘油占5%，無菌水占95%)中，移至4℃冰箱中保藏。

2 結果與分析

2.1 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲病原真菌的數(shù)量分析 由圖1可知，20種植物根際的昆蟲病原真菌數(shù)量表現(xiàn)出一定的差異。真菌菌落數(shù)量從高到低順序為天葵、虎耳草、箬竹、常春藤、鐵線蕨、中華石楠、白葉莓、野薔薇、云臺南星、絡石、紫背天葵、早熟禾、山胡椒、蛇莓、細葉麥冬、杉木、大薊、胡頹子、茶樹和腎蕨。其中，天葵根際昆蟲病原真菌數(shù)量最高，為3.7×104cfu/g;而腎蕨根際昆蟲病原真菌含量最低，未分離出菌落。分離到的昆蟲病原真菌種類數(shù)量的變化趨勢與菌落數(shù)量相似。野薔薇和天葵根際昆蟲病原菌種類最多，為7種，腎蕨根際未分離到真菌。由此可見，不同植物根際昆蟲病原真菌種群數(shù)量差異較大。

2.2 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲病原真菌的科屬分析 通過對馬鬃嶺自然保護區(qū)15種草本植物、4種灌木和1種喬木根系采集，利用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，共分離得到昆蟲病原真菌306株，根據(jù)菌落形態(tài)、質地、顏色等宏觀形態(tài)及顯微形態(tài)特征(圖2)，初步歸為2科7屬15個種。其中12個種為已知種，3個為未定種。2科分別為半知菌類的叢梗孢科和瘤座孢科。7屬分別為棒束孢屬、白僵菌屬、綠僵菌屬、紫孢菌屬、普可尼亞屬、輪枝孢屬和Simplicillium。從梗孢科種類最多，共4屬12種，占全部種類的79.99%。從表1可知，棒束孢屬、白僵菌屬和綠僵菌屬為優(yōu)勢屬，含11種，占春季馬鬃嶺自然保護區(qū)植物根際昆蟲病原真菌的73.32%。其他4屬都只有1種，種數(shù)占26.68%?？梢姡杭抉R鬃嶺自然保護區(qū)不同植物根際昆蟲病原真菌優(yōu)勢屬種現(xiàn)象明顯。

圖1 不同植物根際昆蟲病原真菌菌株數(shù)量和種類統(tǒng)計

表1 馬鬃嶺植物根際昆蟲病原菌科、屬統(tǒng)計

2.3 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲病原真菌的種類分布 春季馬鬃嶺自然保護區(qū)植物根際昆蟲病原真菌的分離比率為95%，20種植物中僅腎蕨沒有分離到昆蟲病原真菌，且菌株數(shù)量和菌種都較豐富。分離出了球孢白僵菌、綠僵菌屬、環(huán)鏈棒束孢、玫煙色棒束孢、粉棒束孢、爪哇棒束孢、輪枝孢等昆蟲病原真菌。其中以白僵菌屬真菌分布最廣泛且菌株數(shù)量大，20種植物根際中有17種植物分離出白僵菌，且所得菌落數(shù)量較大?？梢?，白僵菌屬真菌是該區(qū)域春季植物根系優(yōu)勢真菌，其次是玫煙色棒束孢和淡紫紫孢菌。布氏白僵菌和普可尼亞屬真菌都僅有1種植物根際分離到，分離比率僅為5%(表2)。

3 結論

試驗結果表明，安徽省六安市馬鬃嶺自然保護區(qū)植物根際昆蟲病原真菌物種多樣性較豐富，共分離出2科7屬15個種，以球孢白僵菌數(shù)量最多，其次是玫煙色棒束孢和淡紫紫孢菌。研究發(fā)現(xiàn)靶標昆蟲和病原體大部分相互作用的位置是寄主植物根際，意味著植物根際在將來可以被考慮作為篩選真菌菌株的載體，同時也提高了利用根際微生物進行害蟲防治的可能性，增加了利用昆蟲病原真菌對農作物進行保護的新領域。

圖2 部分分離菌株的菌落性狀與顯微觀察

表2 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲病原真菌種類及分布

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