丁佩佩，何　綱，陳曉華，甄沛林，吳興柳，胡長(zhǎng)征

HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細(xì)胞17和IL-17A水平檢測(cè)*

丁佩佩，何綱，陳曉華，甄沛林，吳興柳，胡長(zhǎng)征

【摘要】目的探討HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細(xì)胞17（Th17）及白細(xì)胞介素（IL）-17A的免疫調(diào)節(jié)作用。方法隨機(jī)選取HIV/HCV共感染者、HIV感染者、HCV感染者和健康人各30例，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量和Th17數(shù)量，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17A水平。結(jié)果HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴細(xì)胞分別為（310.23±114.35）個(gè)/μl和（218.42±112.47）個(gè)/μl，均較健康人明顯降低［（735.46±121.52）個(gè)/μl，P＜0.05］，HIV/HCV共感染者較HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞更低（P＜0.05），HCV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)為（719.47±123.72）個(gè)/μl，與健康人比較無顯著性差異；HIV感染者Th17百分比和IL-17A水平分別為（2.48± 0.90）%，和（25.18±12.63）pg/ml，均較健康人顯著降低［（3.95±1.23）%和（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］，HCV感染者Th17百分比和IL-17A為（5.48±0.90）%和（45.24±15.72）pg/ml，顯著高于健康人（P＜0.05），而HIV/HCV共感染者Th17百分比為（1.76±0.42）%，IL-17A為（16.49±7.54）pg/mL，均顯著低于HIV感染者［（2.48±0.90）%和（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］。結(jié)論合并HCV感染可能通過影響Th17及其細(xì)胞因子IL-17A進(jìn)一步影響HIV患者的免疫功能。

【關(guān)鍵詞】丙型肝炎；艾滋病；T淋巴細(xì)胞；輔助性T細(xì)胞17；白細(xì)胞介素17A

HIV和HCV兩種病毒有著共同的傳播途徑，故兩者合并感染率高。據(jù)有關(guān)流行病學(xué)研究報(bào)告，我國靜脈吸毒人群HIV/HCV合并感染率高達(dá)69.0%～93.6%［1，2］。有研究者認(rèn)為HCV的合并感染會(huì)加速HIV感染者的疾病進(jìn)程［3，4］。也有研究者認(rèn)為HIV感染能加速HCV RNA復(fù)制，加快疾病進(jìn)展，增加患肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)［5］。HCV感染可引起復(fù)雜的病理過程，機(jī)體的輔助性T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞參與了抗病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)。HIV感染可以導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)，CD4+輔助性T細(xì)胞亞群減少，特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答喪失。那么，在HCV/HIV合并感染的復(fù)雜狀態(tài)下，機(jī)體免疫功能失調(diào)會(huì)出現(xiàn)哪些變化？與HIV或HCV單純感染比較會(huì)有哪些不同？這些問題目前還不完全清楚，因而對(duì)其T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控機(jī)制的研究具有極其重要的意義。Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的新的CD4+T細(xì)胞亞群，能夠產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，已成為一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞不但可以通過其分泌的細(xì)胞因子參與各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)也可以與其他免疫細(xì)胞亞群之間相互作用，發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，將固有免疫與獲得性免疫有機(jī)地聯(lián)系起來。研究Th17及其細(xì)胞因子的變化對(duì)明確HIV/HCV共感染者的免疫調(diào)控有重要意義。本研究比較了HIV/HCV共感染者與HIV感染者、HCV感染者和健康人Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平的變化，以探討其在病毒混合感染發(fā)病中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料2012年1月至2014年3月我院就診的HIV/HCV共感染者30例，男18例，女12例；平均年齡（43.12±11.05）歲。HIV感染者30例，男20例，女10例；平均年齡（38.25±15.12）歲。HCV感染者30例，男21例，女9例；平均年齡（35.75±12.34）歲。以上3組患者均未接受抗病毒治療。HIV感染者符合2005年中國《艾滋病診療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，排除合并機(jī)會(huì)性感染患者；HCV感染者符合2004年我國發(fā)布的《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，排除肝硬化患者；HIV/HCV共感染者同時(shí)符合HIV感染和HCV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并機(jī)會(huì)性感染患者及肝硬化患者。以上各組患者均排除高血壓、冠心病、糖尿病、惡性腫瘤等慢性疾病。各組患者年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。另選健康體檢者30例，男19例，女11例；平均年齡（40.12±13.05）歲。本研究在我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液均由美國Gibco公司提供；佛波酯（PMA）、離子霉素（ionomycin）購自美國Sigma Aldrich公司；莫能霉素（monensin）、抗人CD4 PE、抗人IL-17 APC-A購自美國eBioscience公司；抗CD45-CD3-CD4組合抗體和熒光微球購自美國Beckman公司；人白介素-17A（IL-17A）ELISA試劑盒由西唐科技生物有限公司提供；酶標(biāo)儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 2）及洗板機(jī)（Wellwash 4 MK2）由芬蘭Thermo公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀（MACS Quant SN2187）由德國Miltenyi公司生產(chǎn)。

1.3 CD4+T細(xì)胞檢測(cè)于清晨空腹采集肝素抗凝全血8 m1，2 h內(nèi)用人淋巴細(xì)胞分離液分離血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。血漿和PBMC置-80℃凍存。血漿用于檢測(cè)細(xì)胞因子，PBMC用于檢測(cè)Th17細(xì)胞。在各樣品反應(yīng)管中加入EDTA抗凝全血100 μl，加入相應(yīng)的抗CD45-CD3-CD4組合抗體10 μl，輕輕混勻。避光孵育20 min。用相配套溶血素A、B、C液溶血。加入熒光微球100 μl。以CD45陽性細(xì)胞設(shè)門，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析CD3+CD4+雙陽性T淋巴細(xì)胞群。

1.4 Th17細(xì)胞檢測(cè)取上述PBMC，加入刺激劑佛波酯25 ng/ml，離子霉素1 μg/ml和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素1.7 μg/ml，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)等分為測(cè)定管和同型對(duì)照管。加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD8單抗20 μl、藻紅蛋白-青色素染料5（PE—Cy5）標(biāo)記的鼠抗人CD3單抗10 μl，4℃避光孵育20 min。加固定液，室溫避光固定反應(yīng)15 min，離心，棄上清，PBS洗滌2次。加入破膜劑，進(jìn)行細(xì)胞打孔，以利于胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。在測(cè)定管中加入IL-17A-FITC，進(jìn)行胞漿染色，在對(duì)照管中加入相應(yīng)的同型對(duì)照，4℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于PBS液0.5 ml中。在流式細(xì)胞儀上，根據(jù)CD3-SSC設(shè)門，分析CD8陰性細(xì)胞群，檢測(cè)Th17細(xì)胞。

1.5血清細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17A水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS l3.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組人群外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較HIV感染者和HIV/HCV共感染者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞均較健康人降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴細(xì)胞較HIV感染者更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HCV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞與對(duì)照組比較無明顯差異（P＞0.05）；HIV感染者Th17百分比較健康對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者Th17百分比比HIV感染者更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HCV感染者Th17百分比較健康人升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1　4組人群外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)（x±s）的比較

2.2血清IL-17A水平比較HIV感染者Th17型細(xì)胞因子IL-17A較健康人降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者IL-17A比HIV感染者更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HCV感染者IL-17A較健康人升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2　4組人群血清IL-17A水平（x±s）比較

3　討論

HIV感染是一個(gè)緩慢進(jìn)展的長(zhǎng)期免疫損傷過程。在急性感染階段，HIV大量復(fù)制，人體內(nèi)CD4+T細(xì)胞被大量破壞，免疫系統(tǒng)顯著受損；在慢性無癥狀期，HIV與人體免疫系統(tǒng)達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡，但病毒的持續(xù)復(fù)制仍不斷摧毀免疫系統(tǒng)，體內(nèi)CD4+T細(xì)胞不斷下降，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)衰竭，出現(xiàn)各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。因?yàn)榇嬖诠餐膫鞑ネ緩?，HIV/HCV共感染情況在臨床較為常見。目前，世界上HIV與HCV共感染者約為四五百萬人［8］，在靜脈吸毒人群中，HIV合并感染HCV者高達(dá)90%［9］。由于兩種疾病的相互影響，HIV/HCV共感染者往往病情更復(fù)雜。HIV/HCV均可以損害人體的免疫細(xì)胞，對(duì)于兩者共感染情況的免疫功能變化研究對(duì)明確HIV/HCV共感染者的發(fā)病機(jī)制有重要意義。國內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，HIV/HCV共感染者CD4+T細(xì)胞水平較單純感染者更低［10～13］，但機(jī)制尚不清楚。我們研究的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T細(xì)胞水平較健康人明顯降低，其中HIV/HCV共感染者CD4+T細(xì)胞水平比HIV感染者更低，但HCV感染者CD4+T細(xì)胞水平與健康人無明顯差異。由于CD4+T細(xì)胞水平與AIDS發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)，故HIV/HCV共感染者較單純HIV感染者更容易進(jìn)入發(fā)病期。HCV合并感染可能影響了HIV感染者的免疫功能，加速了HIV的發(fā)病過程。

Th17細(xì)胞是一種新的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞型，來源于Th0，具有與Th1、Th2不同的獨(dú)立分化途徑，具有強(qiáng)大的促炎作用［14］，它的發(fā)現(xiàn)不僅彌補(bǔ)了Th1/Th2細(xì)胞軸介導(dǎo)免疫效應(yīng)的不足，而且完善了Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)理論。Th17細(xì)胞參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，在各種炎性疾病和自身免疫性疾病中均有重要意義［15～18］。Th17主要通過分泌細(xì)胞因子，募集活化中性粒細(xì)胞，刺激上皮細(xì)胞，產(chǎn)生防御作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要包括IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 和TNF等，這些細(xì)胞因子具有動(dòng)員、募集及活化中性粒細(xì)胞的功能［15］，而其中最重要的效應(yīng)因子是IL-17。IL-17家族包括 IL-17 A～F共 6位成員，其中IL-17A能產(chǎn)生較強(qiáng)的致炎效應(yīng)［16］。Thl7的反應(yīng)很可能早于Thl或Th2型免疫反應(yīng)，出現(xiàn)在感染的早期階段，誘發(fā)組織炎癥，并通過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，橋接先天免疫和適應(yīng)性免疫，在炎癥后期吸引其他亞群的T細(xì)胞，向感染部位募集。有研究顯示，HIV感染者體內(nèi)Th17明顯減少，而且其在HIV感染的早期就出現(xiàn)明顯降低［19］，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確。也有研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染者體內(nèi)Th17有升高，其升高程度與干擾素的治療效果相關(guān)［20］。雖然目前對(duì)Thl7細(xì)胞與HIV/HCV的研究?jī)H處于初步探索階段，但是相信隨著不斷的深人研究，其在免疫損傷機(jī)制中的作用將有可能被闡明。

我們的研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者 Th17細(xì)胞及IL-17A水平均較健康人明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HIV感染可能通過Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17A影響患者的免疫功能。相反，HCV感染者Th17細(xì)胞及IL-17A水平均較健康人明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HCV感染也可引起Th17及其細(xì)胞因子的變化，此種變化為上調(diào)Th17細(xì)胞和IL-17A水平，也可影響患者的免疫功能。

那么，HIV和HCV的合并感染是否會(huì)對(duì)HIV感染者Th17細(xì)胞及IL-17A水平造成影響，從而進(jìn)一步影響HIV感染者的免疫功能呢？目前國內(nèi)外在這方面的研究比較少見。本研究發(fā)現(xiàn)HIV/HCV共感染者Th17細(xì)胞及IL-17A水平未如預(yù)期的那樣低，或許受到HCV的共同作用而使其處于兩組單純感染者的中間水平，反而是較HIV單純感染者更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故我們認(rèn)為在HIV/HCV共感染者中，HCV的合并感染進(jìn)一步加劇了患者Th17細(xì)胞及IL-17A水平的損害，并可能通過Th17通道進(jìn)一步損害患者的免疫功能，最終加快HIV的發(fā)病過程。

我們的研究表明HCV合并感染可能通過影響Th17及其細(xì)胞因子IL-17A進(jìn)一步損害HIV患者的細(xì)胞免疫功能。加強(qiáng)對(duì)Th17及其細(xì)胞因子IL-17A的研究將有助于進(jìn)一步理解HIV/HCV共感染者的發(fā)病機(jī)制，為新的治療策略提供重要的研究方向。

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（收稿：2014-07-07）（本文編輯：陳從新）

第一作者：丁佩佩，女，34歲，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。主要從事傳染病臨床與科研工作。E-mail：dingpeipei120@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.008

*基金項(xiàng)目：廣東省江門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：江科［2012］107-70）

作者單位：529030廣東省江門市中心醫(yī)院感染病科

Th17 cell counts in peripheral blood and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients Ding Peipei，HeGang，ChenXiaohua，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，JiangmenCentralHospital，Jiangmen 529030，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To explore the changes in Thl7 cell counts and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients.Methods Thirty HIV/HCV co-infected patients，30 HIV infected patients，30 HCV infected patients and 30 healthy subjects were selected in this study.The percentage of CD4+T cells and Th17 cells in peripheral blood，and IL-17A in sera were detected by FCM and ELISA，respectively.Results The percentage of CD4+T cells in HIV and HIV/HCV co-infected patients were（310.23±114.35）/μl and（218.42±112.47）/μl，respectively，both were significantly lower than that in the healthy controls［（735.46±121.52）/μl，P＜0.05］，while the percentage of CD4+T cells in HIV/HCV co-infected group was even lower than in HIV infected patients（P＜0.05）；There was no significant difference in CD4+T cells between HCV infected patients［（719.47±123.72）/μl］ and the controls；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV infected patients were（2.48±0.90）%and （25.18±12.63）pg/ml，significantly lower than those in the controls［（3.95±1.23）%and（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HCV infected patients were（5.48±0.90）%and （45.24±15.72）pg/ml，significantly higher than those in the controls（P＜0.05）；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV/HCV co-infected patients were（1.76±0.42）%and（16.49±7.54）pg/ml，both significantly lower than those in HIV infected patients［（2.48±0.90）%and（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］.Conclusions Co-infection of HCV may influence the immune response in HIV infected patients，which might lead to the involvement of Th17 and IL-17A cytokine.

【Key words】Hepatitis C；Human immunodeficiency virus；T lymphocytes；T helper cell 17；Interleukin 17A