王金濤， 陳超云，2， 李志昊， 佟 林，劉子勇， 張 瓏， 羅志東

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京100029； 2.中國計量學(xué)院，浙江杭州310018；3.貴州省計量測試院，貴州貴陽550003）

超微量液體容積雙波長參比測量方法研究

王金濤1， 陳超云1，2， 李志昊1， 佟 林1，劉子勇1， 張 瓏1， 羅志東3

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京100029； 2.中國計量學(xué)院，浙江杭州310018；3.貴州省計量測試院，貴州貴陽550003）

為克服靜力稱重法受蒸發(fā)量影響大的不足，同時適應(yīng)在線測量的需要，基于Lambert-Beer定律，研究了520 nm和730 nm雙波長超微液體容量光度吸收測量法，通過稀溶液濃度與吸光度之間的線性關(guān)系可以計算出待測超微量液體容積。設(shè)計了雙波長參比光度吸收法的測量系統(tǒng)，采用與靜力稱重測量系統(tǒng)比對試驗的方式對這種方法進行了驗證，1μL和5μL微量液體試驗數(shù)據(jù)表明：雙波長參比光度吸收法和靜力稱重法測量結(jié)果具有良好的一致性，均符合ISO 8655的技術(shù)要求。與靜力稱重法方法相比，雙波長參比光度吸收法對測量環(huán)境要求低，易于實現(xiàn)在線測量，而且可以有效減少液體蒸發(fā)對測量結(jié)果的影響。

計量學(xué)；超微量液體；容量；比對試驗；雙波長參比

1 引 言

為了適應(yīng)DNA基因測序領(lǐng)域等實驗的要求，自動取樣的容積值范圍向超微量方向發(fā)展，如1 μL量級。但是研究和使用中發(fā)現(xiàn)，超微量液體取樣裝置的失準(zhǔn)率較高，因此必須通過周期性的性能測試和校準(zhǔn)來監(jiān)控超微量液體取樣裝置的準(zhǔn)確性和可靠性［1，2］。為了適應(yīng)現(xiàn)代大型生物醫(yī)學(xué)試驗和生產(chǎn)在線測量的需求，國際計量局技術(shù)咨詢委員會CCM.FF已經(jīng)將超微容量校準(zhǔn)列入國際關(guān)鍵比對Key Comparison計劃，以此來進一步推動該領(lǐng)域的國際間測量能力提升［3，4］。

目前主要使用靜力稱重法（Hydro-weighting方法，HW方法）進行超微量液體容積的計量校準(zhǔn)。其基本原理為通過液體質(zhì)量和密度的測量進行液態(tài)容量值的計算，具體可分為高鐵氰化鉀法、水稱重法和水銀稱重法等。前兩種方法準(zhǔn)確性較差，后一種方法雖然優(yōu)于前兩種，但操作繁瑣，對設(shè)備要求高，且水銀容易揮發(fā)，對人體有害［5］。研究表明即使10μL左右的取液值在容量計量中已經(jīng)屬于微小容積計量測量，在靜力稱重測量中由于液體揮發(fā)而造成大的誤差，而且工作時間長，難以保證超微量液體取樣量校準(zhǔn)的準(zhǔn)確度。對于蒸發(fā)量的控制，主要有系數(shù)修正和飽和蒸汽抑制兩種解決方法。這兩種方法進行蒸發(fā)量控制的方法效果有待提高，而且靜力稱重法需要在精密實驗室內(nèi)離線測量，很難進行在線測量使用［6］。

本文根據(jù)雙波長參比光度吸收（DWP）原理提出了一種非靜力稱重測量方法，用于超微量液體取樣容積量的在線校準(zhǔn)，并通過與靜力稱重法測量值進行了試驗比對，驗證了這種方法的有效性。

2 DWP方法基本原理

根據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻的、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度A與溶液濃度c和液層厚度b的乘積成正比

式中ε為比例常數(shù)，與入射光波長和環(huán)境溫度等參數(shù)有關(guān)。選取顯色劑作為待測液體，吸收波長為λS，比例常數(shù)為εS，濃度為cS，待測體積為未知量VU；稀釋劑的吸收波長為λD，比例常數(shù)為εD，濃度為cD，體積為VD。將稀釋比為R的顯示劑溶液加入樣品池中，在波長λS和λD處的吸收度為［7，8］：

式中LSV為樣品測量的光程。重新放入一個新的樣品池，加入體積為VD的稀釋液，測量λD處的吸收度為

式中AD1為背景噪聲，LS為樣品測量的光程。通過待測加樣設(shè)備加入體積為VU的顯色液，測量λS處的吸收度為

由式（2）～式（5）得待測超微量溶液的容積VU為：

式（6）表明這種測量方法不受光程和吸收常數(shù)等因素的影響，測量結(jié)果主要取決于標(biāo)準(zhǔn)顯色劑溶液稀釋比R和光譜讀數(shù)相對值：前者通過Class A標(biāo)準(zhǔn)玻璃容器進行稀釋可以保證R具有很低的相對不確定度（10-4量級）；后者與光譜強度絕對值的測量精度相比，不確定度也大大降低。所以這種方法可以有效保證測量的不確定度，有效避免了液態(tài)介質(zhì)蒸發(fā)帶來的影響，而且對環(huán)境要求低。

3 試驗與分析

為了驗證本文提出的DWP測量方法的有效性，設(shè)計了與高精度超微量靜力稱重法測量系統(tǒng)的比對試驗。為了保證靜力稱重法參考值的準(zhǔn)確性，其中部分取樣點在中國計量科學(xué)研究院和芬蘭BIOHIT校準(zhǔn)試驗室分別進行測量。

3.1 比對試驗系統(tǒng)介紹

3.1.1 DWP方法測量系統(tǒng)設(shè)計

DWP方法測量系統(tǒng)中采用520 nm和730 nm作為參比值測量用波長，所采用的原液和稀釋液分別為Ponceau S水溶液和CuCl2·2H2O與EDTA混合水溶液［8］。

具體配置方法為：

①將0.476 g的Ponceau S加入水，配制成1 000ml溶液，作為原液；

②將1.12 g CuCl2·2H2O和3.74 g EDTA混合，加入水至1 000m l，作為稀釋液；

③從原液中取5 ml加入125 ml稀釋液中，混合液體為標(biāo)準(zhǔn)液。

光譜強度測量方法是保證吸光度數(shù)值準(zhǔn)確的關(guān)鍵量，測量原理如圖1所示。

信號光由一個標(biāo)準(zhǔn)光纖接口進入光學(xué)平臺，先經(jīng)一個球面鏡準(zhǔn)直，然后由一塊平面光柵把該準(zhǔn)直光色散，經(jīng)由第二塊球面鏡聚焦，最后光譜的像就被投射到一個面陣式CCD探測器陣列上，得到不同波長的光譜響應(yīng)，將這些連續(xù)波長響應(yīng)值進行計算機采集和數(shù)據(jù)計算。面陣式CCD探測器陣列比線陣式CCD探測器陣列接收光信號的區(qū)域大，所以能有效提高測量系統(tǒng)的靈敏度。

圖1 光譜強度測量原理圖

3.1.2 靜力稱重法測量系統(tǒng)設(shè)計

按照ISO 8655和JJG 646—2006的要求，設(shè)計了0.1μL～10mL超微量移液靜力稱重法計量校準(zhǔn)系統(tǒng)，最大允許誤差±（0.02～60）μL，超微量稱重工作站參數(shù)如表1所示。

表1 微量稱重工作站測量參數(shù)

靜力稱重測量系統(tǒng)對試驗環(huán)境有嚴(yán)格要求，具體參數(shù)為：工作環(huán)境溫度（20±1）℃，相對濕度控制30%～60%，工作臺面防震、防塵、遠(yuǎn)離熱源，且環(huán)境溫度1 h變化不大于1℃，檢定介質(zhì)與室溫相差不大于2℃。

采用Anton Paar公司的DMA5000 U型管震蕩原理密度測量設(shè)備來測定液體樣品的密度，密度測量分辨率為1×10-6g／cm3。

容積值計算公式為：

式中：V20為標(biāo)準(zhǔn)溫度20℃時移液裝置的實際容量，m3；m為被檢移液裝置所排出的蒸餾水表觀質(zhì)量，kg；ρb為砝碼密度，取8 000 kg／m3；ρa為檢定時實驗室內(nèi)的空氣密度，取1.2 kg／m3；ρw：蒸餾水在t℃時的密度，kg／m3，使用Tanaka公式，具體定義為［9，10］：

式中：t為測量介質(zhì)水的溫度，℃；a1＝-3.983 035℃；a2＝301.797℃；a3＝522 528.9℃2；a4＝69.348 81℃；a5＝999.974 950 kg·m-3；β為被檢移液裝置的體脹系數(shù)，取2.4×10-4／℃；t為檢定時蒸餾水的溫度，℃。

3.2 試驗數(shù)據(jù)分析

使用一個1.0μL移液器進行雙波長光度吸收法和靜力稱重法的試驗比對。為了保證測量數(shù)據(jù)的有效性，分別在中國計量科學(xué)研究院和芬蘭BIOHIT校準(zhǔn)實驗室對這個移液器分別進行靜力稱重法測量（測量結(jié)果分別用HW_NIM和HW_BIOHIT表示），然后用DWP方法再進行測量。數(shù)據(jù)比較如圖2和表2所示。

圖2 1.0μL DWP方法和HM方法試驗數(shù)據(jù)比較

表2 1.0μL測量點量值偏差與重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差 （%）

計算出量值偏差E與重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差S：

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)比較分析：對于1.0μL測量點，靜力稱重法測量結(jié)果HW_NIM和HW_BIOHIT數(shù)據(jù)一致，可以認(rèn)為作為參考值的靜力稱重法測量值有效；DWP方法測量系統(tǒng)的測量值大于靜力稱重法的測量值，測量偏差E為6.08%；就測量重復(fù)性而言，光度吸收法測量系統(tǒng)測量重復(fù)性S為1.31%，與靜力稱重法測量系統(tǒng)測量重復(fù)性接近。

同樣使用一個5.0μL移液器進行光度吸收法和靜力稱重法的試驗比對，數(shù)據(jù)比較如圖3所示。

量值偏差E與重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差S數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 5.0μL測量點量值偏差與重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）

圖3 5.0μL光度吸收法和靜力稱重法試驗數(shù)據(jù)

根據(jù)圖中的數(shù)據(jù)比較分析，對于5.0μL測量點，DWP方法測量系統(tǒng)的測量值大于靜力稱重法的測量值，測量偏差E為1.42%，而靜力稱重法的測量偏差一般小于1.00%；就測量重復(fù)性而言，DWP方法測量系統(tǒng)測量重復(fù)性S為0.22%，與靜力稱重法測量系統(tǒng)重復(fù)性接近。

從1.0μL和5.0μL測量數(shù)據(jù)分析，DWP方法與靜力稱重法測量結(jié)果基本一致，但測量值偏大，原因之一在于DWP方法有效減少了液體蒸發(fā)。

5 結(jié) 論

基于Lambert-Beer定律，研究了520 nm和730 nm雙波長超微液體容量光度吸收測量法（DWP方法），通過稀溶液濃度與吸光度之間的線性關(guān)系可以計算出待測超微量液體容積。

設(shè)計了DWP非靜力稱重方法的測量系統(tǒng)，以ISO 8655為技術(shù)參考依據(jù)，采用與靜力稱重測量系統(tǒng)比對試驗的方式對這兩種方法進行了驗證，1μL和5μL試驗數(shù)據(jù)表明：DWP測量方法和靜力稱重法測量結(jié)果具有良好的一致性，均符合ISO 8655的技術(shù)要求，但測量值偏大，原因在于DWP測量方法能有效減少液體蒸發(fā)。

DWP方法為微小液體容量計量提供了一種較好的解決方案，與HW方法相比，對測量環(huán)境要求低，易于實現(xiàn)在線測量，而且可以有效減少液體蒸發(fā)對測量結(jié)果的影響。

致謝：本研究中與芬蘭BIOHIT校準(zhǔn)實驗室（卡亞里）、芬蘭BIOHIT校準(zhǔn)實驗室（赫爾辛基）、BIOHIT移液裝置校準(zhǔn)實驗室（蘇州）和貴州省計量測試院進行了有效合作，他們在技術(shù)方案論證和試驗條件保障方面做出了卓越的貢獻。

］

［1］ 廉育英.容量計量技術(shù)［M］.北京：北京計量出版社，2006.

［2］ McMillan N，O’Neill，M，Smith S，et al.Reliable TLDA-microvolume UV spectroscopy with applications in chemistry and biosciences formicrolitre analysis and rapid pipette calibration［J］.Journal of Optics A：Pure and Applied Optics，2009，11（5）：1-10

［3］ Batista E，Arias R，Wang J T.Final report on BIPM／CIPM key comparison CCM.FF-K4.2.2011：Volume comparison at 100μL—Calibration of micropipettes（piston pipettes）［J］.Metrologia，2013，50：07003.

［4］ Batista E，Pinto L，F(xiàn)ilipe E，et al.Calibration of micropipettes：Testmethods and uncertainty analysis［J］.Measurement：Journal of the International Measurement Confederation，2007，40（3）：338-342.

［5］ Aibe V Y.Water massmeasurementm parts for volume standard calibration in tlie key comparison［C］／／FLOMEKO，14th International Flow Measurement Conference，Sandton，South Africa，2007：145-148.

［6］ Madec T，Amarouche S.Comparison of micropipettes calibration by accredited laboratories［C］／／3rd International Metrology Conference 2010，CAFMET 2010，2010，Marrakech，Morocco，2010：337-343.

［7］ 楊禹哲，廖鵬.農(nóng)藥殘毒快速測定儀校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及方法的研究［J］.計量學(xué)報，2010，31（5A）：78-79.

［8］ 李亞萍，張廣軍，李慶波.空間雙光路紅外C02氣體傳感器及其測量模型［J］.光學(xué)精密工程，2009，17（1）：14-19.

［9］ Batista E，Richard P.The selection of water property formulae for volume and flow calibration［J］.Metrologia，2007，44（6）：453-463.

［10］ Tanaka M，Girard G，Davis R，et al.Recommended table for the density of water between 0℃and 40℃based on recent experimental reports［J］.Metrologia，2001，38：301-309.

Study on Dual-wavelength Photometric Method for Ultra Micro Liquid Volume Measurement

WANG Jin-tao1， CHEN Chou-yun1，2， LIZhi-hao1， TONG Lin1，LIU Zi-yong1， ZHANG Long1， LUO Zhi-dong3
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2.China Jiliang University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China；3.Guizhou Institute of Metrology，Guiyang，Guizhou 550003，China）

In order to overcome the shortcoming of significant influence of evaporation capacity on hydro-weighting method，a dual-wavelength photometric method based on Lambert-Beer law at 520 nm and 730 nm was introduced.Micro liquid volume to be measured can be calculated through the linear relation between dilute solution concentration and absorbance.Comparing with the gravimetric method，experimental systems for dual-wavelength photometric method is designed.The test data at1μL and 5μL indicates that dual-wavelength photometric method is in good conformance with gravimetric method，and meet the technical requirement of ISO 8655，but the measured value of dual-wavelength photometric method is a little bigger.dual-wavelength photometricmethod is able to provide a good solution formicro liquid volumemeasurement.By comparing with gravimetricmethod，dual-wavelength photometricmethod is low in requirement of measurement environment，and easy to realize the online calibration and capable of effectively reducing the influence of liquid evaporation.

Metrology；Ultra-micro liquid；Volume；Comparison experiment；Dual-wavelength photometric method

TB938.3

：A

：1000-1158（2015）03-0256-04

10.3969／j.issn.1000-1158.2015.03.08

2013-09-26；

：2014-01-07

國家自然科學(xué)基金（51105347，51475440）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項基金（AHY0711）

王金濤（1976-），男，山東臨沂人，中國計量科學(xué)研究院副研究員，主要從事容量計量方面的工作。wangjt＠nim.ac.cn