朱杰，姜宏，何瑞冰，汪存利，殷慧群，李洋

（中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230031）

延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)時(shí)間至囊胚階段行囊胚移植，能夠進(jìn)一步篩選出發(fā)育潛能高、染色體異常率低的胚胎，獲得更高的胚胎種植率和更低的流產(chǎn)率［1-2］。然而，囊胚形成具有不確定性，約有60%的胚胎在囊胚培養(yǎng)過程中失?。?］。囊胚培養(yǎng)失敗導(dǎo)致移植周期取消，對(duì)患者及醫(yī)務(wù)人員帶來極大的心理負(fù)擔(dān)，并且囊胚移植的妊娠結(jié)局是否一定優(yōu)于卵裂胚胎移植尚無定論［4］。有研究表明，卵裂期胚胎移植后，剩余姐妹（sibling）胚胎的囊胚形成率與其臨床妊娠率存在正相關(guān)，認(rèn)為移植卵裂胚可能與姐妹胚胎體外形成的囊胚具有相似的發(fā)育潛能［5-6］。本研究通過回顧性分析188個(gè)周期卵裂胚移植后，姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后囊胚形成與其臨床結(jié)局的關(guān)系，并與266個(gè)囊胚移植周期進(jìn)行比較，旨在探討IVF-ET 過程中的胚胎移植策略以及姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后囊胚形成率對(duì)IVF-ET 臨床結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析2013年1月至2014年7月在我院生殖中心實(shí)施IVF／ICSI-ET 的臨床資料，共454個(gè)周期。本研究分為兩組：將受精后第3天（D 3）卵裂胚移植后可利用胚胎行囊胚培養(yǎng)設(shè)為A 組（188個(gè)周期），行全囊胚培養(yǎng)并移植優(yōu)質(zhì)囊胚設(shè)為B 組（266個(gè)周期）。根據(jù)有無優(yōu)質(zhì)囊胚形成再將A 組分為優(yōu)質(zhì)囊胚形成組（A1組，127個(gè)周期），無優(yōu)質(zhì)囊胚形成組（A2組，61個(gè)周期）。納入標(biāo)準(zhǔn)：均采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案或改良超長(zhǎng)方案促排卵，女方年齡≤38歲，基礎(chǔ)FSH ≤10 mU／ml，體重指數(shù)（BMI）：18.5～24.0kg／m2，無子宮畸形及輸卵管積水，周期獲卵數(shù)≥8枚，A 組和B組D 3均至少有5枚優(yōu)質(zhì)胚胎；卵裂胚移植后至少有5枚可利用姐妹卵裂胚行囊胚培養(yǎng)。患者夫婦在囊胚培養(yǎng)前均已告知風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用本中心的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案或改良超長(zhǎng)方案進(jìn)行促排卵［7］。促排卵過程中根據(jù)血清LH、E2水平及卵泡發(fā)育速度調(diào)整Gn劑量，當(dāng)至少有3個(gè)卵泡直徑達(dá)18mm 時(shí)肌注重組人絨毛膜促性腺激素（rHCG，艾澤，Merck，德國(guó)）250μg，34～36h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。

2.胚胎培養(yǎng)、移植及臨床結(jié)局：卵丘復(fù)合物充分洗滌后放入含血清蛋白的受精培養(yǎng)液（G-IVFPLUS，Vitrolife，瑞典）中，置37℃，6%CO2培養(yǎng)箱2～4h，根據(jù)精液參數(shù)實(shí)施常規(guī)IVF 或ICSI。次日評(píng)估卵母細(xì)胞受精情況，D3參照Cummins評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)估。Ⅰ級(jí)：卵裂球勻稱，無碎片或碎片＜5%；Ⅱ級(jí)：卵裂球較勻稱，碎片≤20%；Ⅲ級(jí)：卵裂球不勻稱，碎片20%～50%；Ⅳ級(jí)：卵裂球不勻稱，碎片＞50%。本中心將D3 卵裂球數(shù)目≥5的Ⅱ級(jí)及以上胚胎和≥6的Ⅲ級(jí)及以上胚胎定義為可利用胚胎，其中卵裂球數(shù)目≥6的Ⅰ級(jí)胚胎和卵裂球數(shù)目≥7 的Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。達(dá)到囊胚培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)后，對(duì)可利用胚胎行囊胚培養(yǎng)。將胚胎移入已平衡好的囊胚培養(yǎng)液中（G-2PLUS，Vitrolife，瑞典），置于37℃，5%CO2，90%N2和5% O2三氣培養(yǎng)箱（Planer BT37，Origio，美國(guó)），培養(yǎng)至D5～D6，按照Gardner囊胚分級(jí)法［9］對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)培養(yǎng)D5的囊胚擴(kuò)張≥3期，D6囊胚擴(kuò)張≥4期，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞評(píng)分均高于C級(jí)時(shí)為優(yōu)質(zhì)囊胚，未達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)為非優(yōu)質(zhì)囊胚。D3選擇2～3 枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚移植，D5 選擇1～2 枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植。移植14d 后，血清或尿HCG 檢測(cè)陽性為生化妊娠，35d后超聲檢查顯示宮內(nèi)孕囊及胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。

3.觀察指標(biāo)：分別比較3組的年齡、不孕年限、HCG 日子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、正常受精率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)與可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù)、異位妊娠率、流產(chǎn)率、周期取消率和臨床妊娠率。周期取消率是指囊胚培養(yǎng)失敗，周期取消的比率。另外還對(duì)囊胚形成率與卵裂胚移植臨床妊娠率進(jìn)行相關(guān)性分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、3組間基本資料和臨床結(jié)局比較

3組間年齡、不孕年限、HCG 日子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、正常受精率、卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)與可利用胚胎數(shù)，優(yōu)質(zhì)胚胎率，移植胚胎數(shù)、異位妊娠率，流產(chǎn)率和周期取消率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），B組臨床妊娠率（69.7%）和種植率（40.1%）均顯著高于A2組（52.5%、28.2%）（P＜0.05），與A1組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。A1組臨床妊娠率和種植率與A2 組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、囊胚形成率與卵裂胚移植臨床妊娠率的關(guān)系

將總囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率按照0～≤10%、10%～≤20%…90%～≤100%劃分為10個(gè)區(qū)間。直線回歸分析顯示，D3卵裂胚移植后囊胚總形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均與臨床妊娠率呈顯著正相關(guān)（分別為r＝0.844和r＝0.867，P＜0.05）（圖1、2）。

表1 3組間基本資料及臨床結(jié)局比較［（±s），%（n）］

表1 3組間基本資料及臨床結(jié)局比較［（±s），%（n）］

注：與A2組比較，＊P＜0.05

組 別 周期數(shù) 年齡（歲）不孕年限（年）HCG 日子宮內(nèi)膜厚度（mm）獲卵數(shù)（枚）成熟卵數(shù)（枚）正常受精率（%）A1組 127 28.9±4.1 5.1±4.0 11.2±2.1 15.3±6.2 13.1±4.8 78.7（1 563／1 987）A2組 61 29.4±4.3 5.0±3.8 11.7±2.2 16.1±5.5 12.6±3.5 79.5（678／853）B組 266 28.3±3.9 4.9±3.9 11.5±2.3 15.4±5.0 13.7±4.1 80.2（2 922／3 643）組 別 周期數(shù) 卵裂率（%） D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚）D3可利用胚胎數(shù)（枚）D3優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）移植胚胎數(shù)（枚）A1組 127 98.6（1 541／1 563） 7.3±2.1 9.6±2.1 66.3（1 021／1 541）2.0±0.3 A2組 61 98.2（666／678） 6.9±1.7 9.4±2.0 61.4（409／666） 2.1±0.4 B組 266 98.3（2 873／2 922） 7.2±2.0 10.1±2.3 68.9（1 981／2 873） 1.8±0.2組 別 周期數(shù) 臨床妊娠率（%）種植率（%）異位妊娠率（%）流產(chǎn)率（%）周期取消率（%）A1組 127 63.8（81／127） 35.6（93／261） 3.7（3／81） 6.2（5／81）0 A2組 61 52.5（32／61） 28.2（37／131） 3.1（1／32） 9.4（3／32） 0 B組 266 69.7（182／261）＊ 40.1（202／504）＊ 3.8（7／182） 4.9（9／182） 1.9（5／266）

圖1 姐妹胚胎總囊胚形成率與臨床妊娠率的相關(guān)分析

圖2 姐妹胚胎優(yōu)質(zhì)囊胚形成率與臨床妊娠率的相關(guān)性分析

討 論

近年囊胚移植的比例逐年上升，Marsh等［10］一項(xiàng)60余萬例IVF 周期回顧分析顯示，囊胚移植占比從2001年的12%上升至2009年的36%，而同期卵裂胚移植比例則從77%下降至55%。有報(bào)道完全擴(kuò)張且高評(píng)分的囊胚具有較高的種植率，薈萃分析顯示囊胚移植可顯著提高胎兒出生率并降低流產(chǎn)率［1，2，11］。本研究的結(jié)果也證實(shí)新鮮周期囊胚移植的胚胎種植率和臨床妊娠率高達(dá)40.1%和69.7%，顯著高于無優(yōu)質(zhì)囊胚形成的卵裂胚移植28.2%和52.5%。雖然各生殖中心越來越多采用囊胚移植，但是我們?nèi)砸獙?duì)這項(xiàng)技術(shù)保持一定謹(jǐn)慎。Bu等［12］在一項(xiàng)多中心、大樣本研究中發(fā)現(xiàn)，囊胚移植組男嬰出生比例顯著高于卵裂胚移植組，該結(jié)論也在其它報(bào)道得到證實(shí)［13-14］，并且囊胚移植較卵裂胚移植增加了嬰兒早產(chǎn)及先天畸形的發(fā)生概率［15］。

臨床上醫(yī)生常根據(jù)患者的年齡、不孕類型（原發(fā)或繼發(fā)）、D3 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、既往IVF 周期情況及激素水平等決定選擇卵裂胚移植或囊胚移植。囊胚移植周期常為女方年齡輕（≤35歲），或IVF反復(fù)種植失敗，以及D3天有4～5 枚以上優(yōu)質(zhì)胚胎者，而對(duì)于一些胚胎數(shù)量少質(zhì)量較差且年齡較大者常選取D3卵裂胚移植。由于在胚胎移植前已人為干擾而非隨機(jī)性，因此兩者臨床結(jié)局的比較常存在偏性。Kang等［16］的結(jié)果表明，當(dāng)女方＜37歲且子宮內(nèi)膜厚度＞8mm 時(shí)，優(yōu)質(zhì)單卵裂胚移植與單囊胚移植在臨床妊娠率、種植率、持續(xù)妊娠率及出生率間并無顯著差異。本研究的結(jié)果顯示，D3移植后剩余姐妹胚胎有優(yōu)質(zhì)囊胚形成的卵裂胚移植可獲得與D5囊胚移植相近的臨床妊娠率和種植率，提示當(dāng)移植具有高發(fā)育潛能的卵裂胚時(shí)可獲得與移植囊胚相似的臨床結(jié)局。

目前胚胎體外培養(yǎng)體系仍在不斷完善中，尚不能完全模擬母體的微環(huán)境，體外囊胚培養(yǎng)失敗并不代表胚胎不能在體內(nèi)發(fā)育形成囊胚。本研究中盡管我們采取了較高的囊胚培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（D3 優(yōu)質(zhì)胚胎≥5枚），但在266個(gè)囊胚培養(yǎng)周期中，仍有5 個(gè)周期完全失敗的案例，雖然發(fā)生幾率僅有1.9%，與卵裂胚移植比并無顯著性差異，但患者情感上仍難以接受本可在D 3移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚，培養(yǎng)至D5 無可移植胚胎的痛苦結(jié)局，并有可能由此引起醫(yī)療糾紛。因此，在D3選擇質(zhì)量較好的卵裂胚移植后行姐妹胚胎囊胚培養(yǎng)不僅可保證患者有胚胎可移植，獲得與囊胚移植相似的臨床結(jié)局，而且新鮮周期移植失敗，凍融囊胚移植仍可取得較滿意的臨床結(jié)局［17］。

本研究通過直線回歸分析姐妹胚胎囊胚形成率與臨床妊娠率的相關(guān)性證實(shí)，姐妹胚胎總囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均與臨床妊娠率呈顯著正相關(guān)，表明姐妹胚胎的囊胚形成率與移植胚胎的發(fā)育及植入潛能相關(guān)，可通過姐妹胚胎的囊胚形成率預(yù)測(cè)卵裂胚移植的臨床結(jié)局。

［1］ Kaur P，Swarankar ML，Maheshwari M，et al.A comparative study between cleavage stage embryo transfer at day 3and blastocyst stage transfer at day 5in in-vitro fertilization／intra-cytoplasmic sperm injection on clinical pregnancy rates［J］.J Hum Reprod Sci，2014，7：194-197.

［2］ Fernández-Shaw S，Cercas R，Bra?a C，et al.Ongoing and cumulative pregnancy rate after cleavage-stage versus blastocyst-stage embryo transfer using vitrification for cryopreservation：impact of age on the results［J］.J Assist Reprod Genet，2015，32：177-184.

［3］ 徐艷文.胚胎發(fā)育潛能的評(píng)估及其研究進(jìn)展［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2011，20：435-437.

［4］ Blake DA，F(xiàn)arquhar CM，Johnson N，et al.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception［J］.Cochrane Database Syst Rev，2007，17：CD002118.

［5］ Mackenna A，Crosby J，Zegers-Hochschild F.Sibling embryo blastocyst development as a prognostic factor for the outcome of day-3embryo transfer［J］.Reprod Biomed Online，2013，26：486-490.

［6］ 宋成，萬才云，鮑忠劍，等.姐妹胚胎體外囊胚形成能力對(duì)體外受精-胚胎移植臨床結(jié)局的預(yù)測(cè)作用研究［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：367-371.

［7］ Zhang WX，Jiang H，Wang XM，et al.Pregnancy and perinatal outcomes of interventional ultrasound sclerotherapy with 98%ethanol on women with hydrosalpinx before in vitro fertilization and embryo transfer［J］.Am J Obstet Gynecol，2014，210：250.

［8］ Cummins JM，Breen TM，Harrison KL，et al.A formula for scoring human embryo growth rates in in vitro fertilization：its value in predicting pregnancy and in comparison with visual estimates of embryo quality［J］.J In Vitro Fert Embryo Transf，1986，3：284-295.

［9］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［10］ Marsh CA，F(xiàn)arr SL，Chang J，et al.Trends and factors associated with the Day 5 embryo transfer，assisted reproductive technology surveillance，USA，2001-2009［J］.Hum Reprod，2012，27：2325-2331.

［11］ Wang SS，Sun HX.Blastocyst transfer ameliorates live birth rate compared with cleavage-stage embryos transfer in fresh in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection cycles：reviews and meta-analysis［J］.Yonsei Med J，2014，55：815-825.

［12］ Bu Z，Chen ZJ，Huang G，et al.Live birth sex ratio after in vitro fertilization and embryo transfer in China—an analysis of 121，247babies from 18centers［J］.PLoS One，2014，9：e113522.

［13］ Luna M，Duke M，Copperman A，et al.Blastocyst embryo transfer is associated with a sex-ratio imbalance in favor of male offspring［J］.Fertil Steril，2007，87：519-523.

［14］ Maalouf WE，Mincheva MN，Campbell BK，et al.Effects of assisted reproductive technologies on human sex ratio at birth［J］.Fertil Steril，2014，101：1321-1325.

［15］ K?llén B，F(xiàn)innstr?m O，Lindam A，et al.Blastocyst versus cleavage stage transfer in in vitro fertilization：differences in neonatal outcome［J］？Fertil Steril，2010，94：1680-1683.

［16］ Kang SM，Lee SW，Jeong HJ，et al.Comparison of elective single cleavage-embryo transfer to elective single blastocystembryo transfer in human IVF-ET［J］.Clin Exp Reprod Med，2011，38：53-60.

［17］ Ku PY，Lee RK，Lin SY，et al.Comparison of the clinical outcomes between fresh blastocyst and vitrified-thawed blastocyst transfer［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1353-1356.