曾勇，梁佩燕，刁梁輝，趙明，黃春宇，陳偉洪，金燕，陳現(xiàn)

（深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

目前全球不孕不育的發(fā)病率約為育齡夫婦的9%，并有逐年升高的趨勢(shì)［1］。IVF-ET 及其衍生技術(shù)是一種有效的治療方法，它的迅速發(fā)展提高了不孕癥治療的成功率。該技術(shù)發(fā)展20多年來(lái)，盡管臨床促排卵方案及胚胎培養(yǎng)技術(shù)有了很大的改善，但I(xiàn)VF-ET 成功妊娠率仍徘徊在30%～50%［2］，其治療效果遠(yuǎn)未達(dá)到人們的期望。在排除高齡、遺傳、內(nèi)分泌和解剖結(jié)構(gòu)等異常因素后，仍有15%左右的不孕患者病因不明［3］，通常這部分患者被定義為不明原因不孕（UI）患者。如何改變UI患者的治療結(jié)局、提高胚胎成功種植率一直是該領(lǐng)域?qū)＜液蛯W(xué)者們所關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，生殖免疫學(xué)研究表明胚胎種植失敗可能與母體的免疫狀態(tài)異常有關(guān)［4］，自身免疫因素在胚胎種植失敗患者中所起的作用已逐漸引起人們的重視。大量研究資料表明自身抗體如抗核抗體（ANA）、抗心磷脂抗體（aCL）和抗β2 糖蛋白I抗體（aβ2-GPI）的存在可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗有關(guān)［5-7］，但與UI的關(guān)系尚不明確。因此，本研究通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)并分析UI患者血清中的ANA、aCL 和aβ2-GPI三項(xiàng)指標(biāo)，綜合判斷對(duì)UI的臨床應(yīng)用價(jià)值，為尋找UI患者的致病因素提供新的診斷指標(biāo)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

本研究選取2015年1 月～4 月首次在本院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF-ET 標(biāo)準(zhǔn)方案的108例UI患者作為研究對(duì)象即UI組。所有患者均經(jīng)過(guò)詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史、全身及婦科檢查、染色體核型分析、宮腔感染和宮腔鏡以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查，入選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）年齡≤35歲；（2）卵巢儲(chǔ)備功能正常；（3）夫婦雙方染色體核型正常，女方無(wú)感染、子宮解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常、無(wú)輸卵管堵塞；（4）男方精液常規(guī)檢查正常；（5）無(wú)自身免疫疾病史；（6）無(wú)手術(shù)史和激素治療史；（7）原發(fā)不孕。同時(shí)選取在本中心工作的具有正常妊娠史的女性，共24 例為對(duì)照組，年齡為21～35歲。

所有患者在IVF-ET 進(jìn)周前當(dāng)月的月經(jīng)周期第3～5天抽取周?chē)?，正常?duì)照組在同期抽取周?chē)?，采血后離心分離血清，分別檢測(cè)血清中ANA、aCL和aβ2-GPI抗體水平。本研究入選患者和正常對(duì)照的志愿者均簽署了檢測(cè)項(xiàng)目知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)流程獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理學(xué)委員會(huì)許可。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要包括Luminex 200蛋白液相芯片系統(tǒng)（Luminex，美國(guó)）和Bio Tek Eon 微孔板分光光度計(jì)（BioTek，美國(guó)）。試劑主要包括AtheNA Multi-LyteTM抗核抗體檢測(cè)試劑盒（Zeus，美國(guó)），抗心磷脂抗體IgG／IgM 測(cè)定試劑盒（Inova，美國(guó)）和抗β2 糖蛋白I抗體IgG／IgM 檢測(cè)試劑盒（Inova，美國(guó)）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.ANA 譜檢測(cè)：ANA 譜的檢測(cè)應(yīng)用多重微珠免疫法，采用AtheNA Multi-LyteTM抗核抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者血清中9個(gè)ANA 標(biāo)志物，包括抗干燥綜合征抗原A 抗體（SSA）、抗干燥綜合征抗原B抗體（SSB）、抗小核糖核蛋白抗體（Sm）、抗核糖核蛋白抗體（RNP）、抗硬皮病70 抗體（Scl-70）、抗組氨酰合成酶轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸抗體（Jo-1）、抗著絲點(diǎn)蛋白B抗體（CentB）、抗組蛋白抗體（AHA）和抗雙鏈DNA 抗體（dsDNA）。血清先用稀釋液按1∶21進(jìn)行稀釋?zhuān)蚋骺字屑尤?0μl微珠懸浮液，再將已1∶21稀釋的樣本各取10μl依次加入到微孔板中，室溫孵育30min后清洗微球，去除不反應(yīng)的血清蛋白。每孔中加入150μl PE 標(biāo)記的羊抗人IgG，混勻，室溫孵育30 min，通過(guò)Luminex 200 對(duì)微球懸浮液進(jìn)行分析。同時(shí)利用內(nèi)校正技術(shù)，內(nèi)對(duì)照顆粒上的熒光信號(hào)可以將讀到的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成濃度（單位）結(jié)果。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：各單個(gè)ANA 濃度＞120U／ml定義為陽(yáng)性。ANA 譜中9個(gè)標(biāo)志物中的一個(gè)或幾個(gè)同時(shí)陽(yáng)性均視為ANA 陽(yáng)性。

2.aCL和aβ2-GPI IgG／IgM 檢測(cè)：aCL 和aβ2-GPI的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法。血清先用稀釋液按1∶101進(jìn)行稀釋?zhuān)偻A(yù)包被板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣品100μl，室溫孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl抗人IgG／IgM HRP 結(jié)合物，室溫避光孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl TMB溶液（3’3’5’5-四甲基聯(lián)苯胺溶液），孵育30min后，加入100μl終止液終止反應(yīng)。于波長(zhǎng)450nm 處讀取OD 值，用折線擬合方式計(jì)算各樣品濃度值。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：aCL-IgG≥20GPL／ml、aCLIgM≥20 MPL／ml，或aβ2-GPI-IgG≥20SGU、aβ2-GPI-IgM≥20SMU 定義為陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)UI患者組和正常對(duì)照組基線資料進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，兩組自身抗體陽(yáng)性率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、UI患者與對(duì)照組基本資料

資料顯示，年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）以及基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素等可能對(duì)自身抗體陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的影響，所以我們比較了UI組和對(duì)照組的基本資料。與對(duì)照組相比，UI組的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、促卵泡雌激素（FSH）、泌乳素（RPL）和孕酮（P）的表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、UI患者血清中ANA 的檢測(cè)結(jié)果

UI患者血清中ANA 總的陽(yáng)性率為14.8%，其中抗SSA、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、CentB、AHA、dsDNA 等 抗 體 的 陽(yáng) 性 率 分 別 為7.4%（8／108）、1.9%（2／108）、0、0.9%（1／108）、0.9%（1／108）、3.7%（4／108）、0.9%（1／108）、1.9%（2／108）和0，正常對(duì)照組中無(wú)一例ANA 陽(yáng)性。兩組ANA總陽(yáng)性率相比，具有顯著性差異（P＜0.05），而兩組間相應(yīng)的單一抗體比較均無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。

三、UI患者血清中aCL檢測(cè)結(jié)果

UI患者血清中aCL 總陽(yáng)性率為38.0%，其中aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽(yáng)性率分別 為25.0%、9.3% 和3.7%。aCL 總 陽(yáng) 性 率 和aCL-IgG 抗體陽(yáng)性率均顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），而aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽(yáng)性率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

四、UI患者血清中aβ2-GPI檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果所示，UI患者血清中aβ2-GPI總陽(yáng)性率為9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPIIgG-IgM 抗體陽(yáng)性率分別為0、9.3%和0，與正常對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表1 UI組與正常對(duì)照組基本資料比較［±s］

表1 UI組與正常對(duì)照組基本資料比較［±s］

組 別 例數(shù) 年齡（歲） BMI（kg／m2） E2（pmol／L） LH（U／L） FSH（U／L） PRL（mU／L） P（nmol／L）UI組 108 30.5±2.9 21.1±1.9 133.6±13.4 4.2±1.6 6.1±1.5 318.1±86.0 0.9±0.1對(duì)照組 24 29.3±2.9 21.1±2.4 124.8±11.1 4.4±1.6 6.8±1.6 358.3±92.5 1.2±0.2

表2 UI組與正常對(duì)照組aCL陽(yáng)性率比較［% （n）］

表3 UI組與正常對(duì)照組aβ2-GPI陽(yáng)性率比較［%（n）］

討 論

近年來(lái)隨著生殖免疫學(xué)的研究進(jìn)展，免疫因素和不孕不育的關(guān)系日益受到人們的重視，一種或多種自身抗體的存在常反映機(jī)體自身免疫狀態(tài)的異常，而不利于女性生殖健康。自身抗體如ANA、aCL和aβ2-GPI被認(rèn)為可能是引起不孕不育癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和其它一些妊娠并發(fā)癥的重要因素［8］。但是，ANA、aCL和aβ2-GPI這3種抗體與UI的潛在相關(guān)性目前報(bào)道較少。因此，本研究希望通過(guò)檢測(cè)和分析UI患者血清中ANA、aCL 和aβ2-GPI的陽(yáng)性率，明確ANA、aCL和aβ2-GPI是否可作為UI患者行IVF-ET 前病因篩查的檢測(cè)指標(biāo)。

ANA 是一組對(duì)自身真核細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和可提取的核抗原等作為靶抗原的自身抗體的總稱(chēng)［9］。ANA 可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞中，產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，中斷細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，使 得DNA 合 成 受 阻［10］。Ying 等［11］研 究 發(fā)現(xiàn)ANA 可影響卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎細(xì)胞分裂，其ANA 陽(yáng)性組MII卵細(xì)胞比率、2PN 受精卵比率、卵裂率和可用胚胎以及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量都顯著低于ANA 陰性組，并且胚胎種植率和臨床妊娠率也顯著降低，由此作者認(rèn)為ANA 對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎細(xì)胞分裂的影響，可能是胚胎在種植前便成為了ANA 攻擊的目標(biāo)。這些結(jié)果提示以細(xì)胞核成分為主要靶目標(biāo)的ANA 很有可能是引起胚胎種植失敗的重要原因。ANA 與包括復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)IVF-ET 失敗等在內(nèi)的多種不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，ANA 陽(yáng)性率可高達(dá)50%［12］，在反復(fù)IVF-ET 失 敗 患 者 中ANA 的 陽(yáng) 性率為35.1%［13］，另外，在IVF-ET 不孕患者中ANA陽(yáng)性率為20%～28.7%［14-15］，而本研究結(jié)果顯示，UI患者ANA 總陽(yáng)性率為14.8%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異。由此推測(cè)，ANA 陽(yáng)性可能與UI有關(guān)。

aCL是抗磷脂抗體（aPLs）的標(biāo)志性抗體之一，主要以血小板和內(nèi)皮細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的心磷脂為靶抗原，在正常生理?xiàng)l件下不存在，一般出現(xiàn)在組織炎癥、粘連及損害后，可引起血管內(nèi)血栓形成，從而引發(fā)胎盤(pán)與蛻膜血流不暢以及供血不足等情況，最終導(dǎo)致流產(chǎn)［16］。aCL 引 起IVF 種 植失 敗 的 可 能 作用機(jī)理為［17］：（1）aCL在卵泡液中聚集，并粘附到卵母細(xì)胞細(xì)胞表面，從而干擾卵母細(xì)胞形成；（2）aCL可直接結(jié)合到胚胎上，導(dǎo)致胚胎發(fā)育延滯和胚胎形態(tài)異常；（3）aCL可抑制子宮內(nèi)膜的蛻膜化，降低子宮內(nèi)膜容受性。目前普遍認(rèn)為aCL 與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇、IVF-ET 失敗等生殖障礙疾病有關(guān)。本研究UI組aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽(yáng)性率分別為25.0%、9.3%和3.7%，與對(duì)照組相比，aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽(yáng)性率無(wú)顯著差異，但aCL總陽(yáng)性率和aCL-IgG 抗體陽(yáng)性率均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），由此我們推測(cè)aCL陽(yáng)性，特別是aCL-IgG 抗體陽(yáng)性可能與UI有關(guān)。本研究UI患者血清中aCL總陽(yáng)性率與早期研究結(jié)果一致（42%）［18］，但顯著高于Radojcic′等［19］報(bào)道的aCL陽(yáng)性率（23.8%）。這種差異性可能主要是由于陽(yáng)性閾值的設(shè)定和檢測(cè)方法不同而引起的。

β2-GPI是由Ⅰ-Ⅴ五個(gè)共同序列的功能區(qū)即補(bǔ)體調(diào)控結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的血漿蛋白質(zhì)，Ⅰ和Ⅴ結(jié)構(gòu)域可與帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，主要以Ⅴ結(jié)構(gòu)域?yàn)橹鲗?dǎo)作用，而 以β2-GPI 為 靶 目 標(biāo) 的aβ2-GPI 或aCL 等aPLs結(jié)合位點(diǎn)位于Ⅰ結(jié)構(gòu)域。研究表明，β2-GPI作為最重要的aPLs結(jié)合輔因子，可與內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞表面受體以及凝血因子相互結(jié)合，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血功能異常等［20］。而aβ2-GPI一方面在血栓形成過(guò)程中具有致病作用，可干擾β2-GPI的抗凝血功能；另一方面，aβ2-GPI可與蛻膜細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)母體子宮內(nèi)膜促炎性狀態(tài)的發(fā)生，產(chǎn)生白 介 素-8 （IL-8）、IL-1 和 單 核 細(xì) 胞 趨 化 蛋 白-1（MCP-1）等促炎細(xì)胞因子，干擾胚胎著床，導(dǎo)致天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）介導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞死亡，而引起妊娠失?。?1］。研究表明aβ2-GPI與IVF種植失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者等不良妊娠結(jié)局有關(guān)，其血清中aβ2-GPI抗體陽(yáng)性率分別為9%和16%，均顯著高于正?？稍袐D女［5］。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)UI患者和正常對(duì)照組血清中aβ2-GPI的陽(yáng)性率，探討aβ2-GPI與UI的關(guān)系。檢測(cè)結(jié)果顯示aβ2-GPI的總陽(yáng)性率為9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPI-IgG-IgM 抗體陽(yáng)性率分別為0、9.3%和0，與正常對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異，由此推測(cè)，aβ2-GPI陽(yáng)性可能與UI無(wú)關(guān)。

同時(shí)，大量的研究表明：對(duì)自身抗體ANA 和aCL陽(yáng)性的IVF-ET 患者給予強(qiáng)的松和阿司匹林治療后，可顯著的提高胚胎種植率和臨床妊娠率［22-23］。而對(duì)自身抗體陽(yáng)性的UI患者進(jìn)行免疫干預(yù)治療的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，這有待于我們進(jìn)一步深入的研究，以期更好的闡明自身抗體陽(yáng)性對(duì)UI患者妊娠結(jié)局的影響，為UI的臨床治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，UI患者血清中ANA 和aCL總陽(yáng)性率顯著高于正常已孕婦女，這可能是UI患者不孕的重要因素之一，可作為UI病因篩查的重要檢測(cè)指標(biāo)。

［1］ Boivin J，Bunting L，Collins JA，et al.International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking：potential need and demand for infertility medical care［J］.Hum Reprod，2007，22：1506-1512.

［2］ Check JH，Katsoff B，Wilson C，et al.Pregnancy outcome following fresh vs frozen embro transfer into gestational carriers using a simplified slow freeze protocol［J］.Clin Exp Obstet Gynecol，2012，39：23-24.

［3］ Forti G，Krausz C.Clinical review 100：Evaluation and treatment of the infertile couple［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83：4177-4188.

［4］ Choudhury SR，Knap PLA.Human reproductive failure I：immunological factors［J］.Hum Reprod Update，2000，7：113-134.

［5］ Stern C，Chamley L，Hale L，et al.Antibodies to beta2 glycoprotein I are associated with in vitro fertilization implantation failure as well as recurrent miscarriage：results of a prevalence study［J］.Fertil Steril，1998，70：938-944.

［6］ Cline AM，Kutteh WH.Is there a role of autoimmunity in implantation failure after in-vitro fertilization？［J］Cur Opin Obstet Gynecol，2009，21：291-295.

［7］ Poulton K，Ripoll VM，Pericleous C，et al.Purified IgG from patients with obstetric but not IgG from non-obstetric antiphospholipid syndrome inhibit trophoblast invasion［J］.Am J Reprod Immunol，2015，73：390-401.

［8］ Shoenfeld Y，Blank M.Autoantibodies associated with reproductive failure［J］.Lupus，2004，13：643-648.

［9］ Fragkou IA，Mavrogianni VS，Cripps PJ，et al.The bacterial florain the teat duct of ewes can protect against and can cause mastitis［J］.Vet Res，2007，38：525-545.

［10］ Yanase K，Madaio MP.Nuclear localizing anti-DNA antibodies enter cells via caveoli and modulate expression of caveolin and p53［J］.J Autoimmun，2005，24：145-151.

［11］ Ying Y，Zhong YP，Zhou CQ，et al.Antinuclear antibodies predicts a poor IVF-ET outcome：impaired egg and embryo development and reduced pregnancy rate［J］.Immunol Invest，2012，41：458-468.

［12］ Ticconi C，Rotondi F，Veqlia M，et al.Antinuclear autoantibodies in women with recurrent pregnancy loss［J］.Am J Reprod Immunol，2010，64：384-392.

［13］ Kaider AS，Kaider BD，Janowicz PB，et al.Immunodiagnostic evaluation in women with reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1999，42：335-346.

［14］ Kikuchi K，Shibahara H，Hirano Y，et al.Antinuclear antibody reduces the pregnancy rate in the first IVF-ET treatment cycle but not the cumulative pregnancy rate without specific medication［J］.Am J Reprod Immunol，2003，50：363-367.

［15］ Taniguchi F.Results of prednisolone given to improve the outcome of in vitro fertilization-embryo transfer in women with antinuclear antibodies［J］.J Reprod Med，2005，50：383-388.

［16］ 彭瑤，黃紅梅，曾欽鳳.生殖免疫自身抗體檢測(cè)在婦科不孕不育診斷中的臨床價(jià)值評(píng)價(jià)［J］.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2013，3：119-121.

［17］ Zhong YP，Ying Y，Wu HT，et al.Impact of anticardiolipin antibody on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer［J］.Am J Reprod Immunol，2011，66：504-509.

［18］ Roussev RG，Kaider BD，Price DE，et al.Laboratory evaluation of women experiencing reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1996，35：415-420.

［19］ Radojcic′L，Marjanovic′S，Vic′ovac L，et al.Anticardiolipin antibodies in women with unexplained infertility［J］.Physiol Res，2004，53：91-96.

［20］ Willis R，Pierangeli SS.Anti-β2-glycoprotein I antibodies［J］.Ann N Y Acad Sci，2013，1285：44-58.

［21］ Meroni PL，Borghi MO，Raschi E，et al.Pathogenesis of antiphospholipid syndrome：understanding the antibodies［J］.Nat Rev Rheumatol，2011，7：330-339.

［22］ Zhu Q，Wu L，Xu B，et al.A retrospective study on IVF／ICSI outcome inpatients with anti-nuclear antibodies：the effectsof prednisone plus low-dose aspirin adjuvanttreatment［J］.Reprod Biol Endocrinol，2013，11：98.

［23］ Geva E，Amit A，Lerner-Geva L，et al.Prednisone and aspirin improve pregnancy rate in patients with reproductive failure and autoimmune antibodies：aprospective study［J］.Am J Reprod Immunol，2000，43：36-40.