潘 然，丁 濱，胡林峰，張福利，丁 蕾，方 波，謝璐帆，竇曉兵

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310053）

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是多病因引起的以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積及肝細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征，包括單純性非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），進(jìn)一步可發(fā)展為肝纖維化，甚至肝癌。肝臟能利用甘油、糖、脂肪酸和甘油一酯為原料，經(jīng)過(guò)磷脂酸途徑和甘油一酯途徑合成甘油三酯（Triacylgycerol，TG）；同時(shí)TG 也能在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，并釋放入血供其它組織利用[1]。已知與TG 代謝相關(guān)的蛋白中二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT）分別是甘油三酯合成代謝、脂肪酸合成及分解代謝途徑中的限速酶。以上3 個(gè)蛋白的異常表達(dá)，直接導(dǎo)致肝臟細(xì)胞TG 聚積，促進(jìn)NAFLD 的發(fā)生和發(fā)展。而過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α（Peroxisome proliferators activated receptor α，PPAR-α）是調(diào)控基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，具有調(diào)控脂肪酸氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)。因此，本研究以蘆丁對(duì)3 個(gè)限速酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控及PPAR-α 調(diào)控因子表達(dá)的影響，探索蘆丁預(yù)防肝細(xì)胞中油酸誘導(dǎo)的TG 聚積的分子機(jī)制。

蘆丁屬黃酮類化合物，又稱蕓香苷、維生素P、紫槲皮苷，存在于蕓香葉、蕎麥花等多種植物中，具有抗炎、抗病毒作用，對(duì)脂肪浸潤(rùn)的肝臟有祛脂作用，臨床上多用于治療腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫瘢和急性出血性腎炎[2-4]。在非酒精性脂肪性肝病的中藥單藥研究中發(fā)現(xiàn)，以蘆丁為主要成分之一的黃酮類化合物有著突出的臨床表現(xiàn)[5]，具有降血糖、降血脂、保肝等作用[6-7]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，蘆丁能通過(guò)降低甘油三酯，改善微循環(huán)，疏通肝內(nèi)血液瘀滯以及抗氧化作用，調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝[8-10]進(jìn)而達(dá)到防治NAFLD 的目的。但是蘆丁治療NAFLD的分子機(jī)制尚不清楚，因此用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)一步揭示蘆丁治療NAFLD 的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，對(duì)于拓展蘆丁應(yīng)用的領(lǐng)域，探索有效預(yù)防NAFLD 的新思路具有積極科學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人肝細(xì)胞株HepG2 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

實(shí)驗(yàn)用PPAR-α 抗體購(gòu)自BOSTER（H1712），β-Actin 抗體購(gòu)自Santa（B1914）。LDH 檢測(cè)試劑盒（317674）、BioEasy Master Mix （SYBR Green）（BSB25L1）均購(gòu)自Thermo。BCA 試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物（BCA-01），Trizol 購(gòu)自Invitrogen（103205）。蘆丁購(gòu)自上海瑞永生物科技（RW95247Q301，純度≥95%），配成10mmol/L 原液待用。引物由上海生工合成，其他化學(xué)試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立

人肝細(xì)胞株HepG2 用含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長(zhǎng)成80%時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)[11]。

制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞按2×105個(gè)/mL 密度接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1mL，將HepG2 細(xì)胞分成4 組：①空白對(duì)照組（UT）：不作任何藥物處理；②蘆丁組（Rutin）：僅用蘆丁處理；③OA 組（OA）：僅用OA 處理；④蘆丁+OA 組（Rutin+OA）：蘆丁預(yù)處理后加入OA 處理。以上4 組每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)組，蘆丁預(yù)處理2h 后向③、④組加入0.5mmol/L OA 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 HepG2 細(xì)胞油紅O 染色

PBS 清洗2 遍，4%多聚甲醛500μL/孔固定30min；稀釋油紅儲(chǔ)存液：油紅∶去離子水＝3 ∶2，濾紙過(guò)濾后室溫放置10min；用過(guò)濾后的油紅O 染液500μL/孔染色10min；用60%異丙醇漂洗脫色，除去多余的染料；40 倍光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3 HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 含量測(cè)定

向油紅O 染色后的培養(yǎng)板內(nèi)加入4% NP40 覆蓋底面，待顏色穩(wěn)定后吸取200μL 上清用于測(cè)定吸光度。

從小到大，陶小西的自行車后座只有溫衡坐過(guò)，他帶她去海邊驅(qū)趕潮汐蟹，帶她去香蕉林偷香蕉，或者偷偷爬上頂樓看日出。誼愛路的居民們沒有人不認(rèn)識(shí)他們，總是看見他們騎著自行車呼嘯而過(guò)，笑他們兩小無(wú)猜。

1.2.4 LDH 測(cè)定

根據(jù)LDH 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性，分析各組間的細(xì)胞毒性作用。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)Trizol 試劑盒一步法提取細(xì)胞和組織總RNA，完成逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所用引物如表1 所示（β-actin 為內(nèi)參對(duì)照）。

表1 引物序列

1.2.6 Western Blot

用裂解法提取總蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定濃度。將各組調(diào)整至相同蛋白濃度后，取20μg 樣本經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)移電泳、抗體免疫（一抗分別為抗PPAR-α 蛋白、抗β-actin 蛋白）、ECL 顯影、曝光等步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)情況（β-actin 做內(nèi)參對(duì)照）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁抑制OA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 的積聚

用20μmol/L 蘆丁預(yù)處理HepG2 細(xì)胞2h，再加入0.5mmol/L OA 孵育過(guò)夜，LDH 結(jié)果顯示，OA 組、Rutin 組、Rutin+OA 組這3 個(gè)處理組細(xì)胞活性與UT組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），見圖1。OA 組細(xì)胞內(nèi)TG 含量是UT 組的1.63 倍（P＜0.05），而與OA 組相比，Rutin+OA 組TG 含量顯著降低，見圖2。該試驗(yàn)結(jié)果與油紅O 染色觀察到的現(xiàn)象相符：OA 作用16 h 后，各組細(xì)胞邊緣清晰，油紅O 染色后鏡下觀察空白對(duì)照組和蘆丁組細(xì)胞內(nèi)幾乎無(wú)紅色脂滴；UT和Rutin 組細(xì)胞內(nèi)幾乎無(wú)紅色脂滴；而OA 組和Rutin+OA 組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯增加，分布在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域，呈現(xiàn)密集小滴狀；但與OA 模型組相比，Rutin+OA 組脂滴量則相對(duì)較少，見圖3。

圖1 對(duì)比分析蘆丁對(duì)脂肪變性HepG2 細(xì)胞毒性的影響

圖2 對(duì)比分析蘆丁對(duì)脂肪變性HepG2 細(xì)胞中TG 含量的影響

圖3 光學(xué)顯微鏡下（200×）觀察各實(shí)驗(yàn)組脂肪變性HepG2 細(xì)胞TG 含量的影響

2.2 蘆丁對(duì)PPAR-α 轉(zhuǎn)錄及翻譯的影響

首先利用Real-time PCR 方法對(duì)比研究PPAR-α 在不同研究組中轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示，如圖4A，與UT 組比較，OA 組細(xì)胞內(nèi)PPAR-α mRNA 表達(dá)量為62.4%，呈顯著降低（P＜0.05），而Rutin+OA 組中PPAR-α 的mRNA 表達(dá)量為284%，呈明顯增加（P＜0.05）。為了進(jìn)一步探究蘆丁對(duì)PPAR-α 蛋白表達(dá)水平的影響，利用兩種不同濃度處理細(xì)胞，Western blotting 結(jié)果如圖4B，與UT 組相比，OA 組中PPAR-α 蛋白表達(dá)變化不明顯，而在兩個(gè)不同Rutin+OA 組中，該蛋白的表達(dá)增加，且與蘆丁濃度正相關(guān)。

圖4 蘆丁對(duì)脂肪變性HepG2 細(xì)胞中PPAR-α在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的調(diào)控

2.3 蘆丁對(duì)各組細(xì)胞中CPT 和DGAT 基因轉(zhuǎn)錄的影響

CPT 是脂肪酸β 氧化途徑中的限速酶，我們首先對(duì)各試驗(yàn)組中該酶的mRNA 表達(dá)情況對(duì)比分析，結(jié)果如圖5A 所示，與UT 組相比，OA 組中CPT 的兩個(gè)亞型（CPT1a 和CPT2）mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；而Rutin+OA 組中兩個(gè)亞型的mRNA 表達(dá)量顯著高于OA 組（P＜0.05）。

蘆丁對(duì)預(yù)防TG 聚積的影響，即可能是促進(jìn)TG的分解也可能是抑制TG 的合成（與DGAT 相關(guān)）。Real-time PCR 結(jié) 果 顯 示，OA 組 中DGAT1 和DGAT2 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別是UT 組的3.75倍和3.94 倍（P＜0.05）。而Rutin+OA 組中DGAT 兩個(gè)亞型的mRNA 表達(dá)量雖未恢復(fù)到正常水平但與OA 組相比已顯著降低，見圖5B。

圖5 蘆丁對(duì)脂肪變性HepG2 細(xì)胞中CTP 及DGAT在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

3 討論

隨著生活水平的日益提高，NAFLD 患病率不斷升高，并呈低齡化發(fā)病趨勢(shì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家，NAFLD 已成為慢性肝病及血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶升高的首要原因，在我國(guó)僅次于病毒性肝炎[12]。NAFLD已成為全球備受關(guān)注的一大公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前公認(rèn)的是Day 的“二次打擊學(xué)說(shuō)”[13]，其中“二次打擊”以脂質(zhì)過(guò)氧化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能損傷為主。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，PPAR-α 的表達(dá)量與NAFLD 存在一定的關(guān)聯(lián)[14-17]：肝臟脂肪酸水平的增高激活PPAR-α 后，誘導(dǎo)脂肪酸氧化的基因轉(zhuǎn)錄，增加對(duì)脂肪酸氧化的能力，進(jìn)而降低脂質(zhì)在肝臟的沉積，在調(diào)節(jié)細(xì)胞脂肪酸代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)中占有重要地位[18-21]。Ying Cai 等人[22]的研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠顯著減少db/db 小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的積聚，降低TG 的含量，同時(shí)在小鼠的肌肉組織檢測(cè)到高濃度的PPAR 族蛋白。Cheng-Hsun W[23]等人報(bào)道，蘆丁能夠通過(guò)減少脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)降低HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG 的積累。本研究也在細(xì)胞水平證明了這一結(jié)果，并且還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蘆丁能夠促進(jìn)PPAR-α 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)，提示其可能通過(guò)PPAR-α 來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝，進(jìn)而降低TG 在肝細(xì)胞內(nèi)的積聚。CPT 是線粒體內(nèi)脂肪酸β-氧化反應(yīng)的限速酶，分CPT1 和CPT2 兩類。CPT1 位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，催化長(zhǎng)鏈脂肪酸從?；o酶A 轉(zhuǎn)移到肉毒堿上進(jìn)而從胞漿進(jìn)入線粒體內(nèi)部，并且進(jìn)一步在位于線粒體內(nèi)膜上的CPT2 催化下進(jìn)行β 氧化[24-27]。我們推測(cè)蘆丁通過(guò)PPAR-α 激活CPT 的轉(zhuǎn)錄。為證實(shí)我們的推測(cè)，我們檢測(cè)了蘆丁對(duì)細(xì)胞內(nèi)CPT 轉(zhuǎn)錄的影響。發(fā)現(xiàn)僅用蘆丁處理反而會(huì)抑制CPT 的轉(zhuǎn)錄，且其抑制效率較OA 更強(qiáng)。但同時(shí)加入蘆丁和OA 處理的細(xì)胞中CPT 的轉(zhuǎn)錄又得以恢復(fù)。體現(xiàn)出中醫(yī)中以毒攻毒，否極泰來(lái)的用藥理念。然而與我們的預(yù)測(cè)不同，蘆丁僅僅通過(guò)PPAR-α 恢復(fù)了原有受抑制的CPT 的轉(zhuǎn)錄。

除了降解途徑，影響肝臟內(nèi)TG 含量的另一個(gè)因素是脂肪酸以及TG 的合成。DGAT 是TG 合成的限速酶，分DGAT1 和DGAT2 兩種亞型，能催化二酰甘油和脂肪酸?；扇８视偷姆磻?yīng)，在TG合成中起到了至關(guān)重要的作用。該酶在細(xì)胞中的濃度與脂肪代謝、脂類在脂肪中的沉積、血漿中TG 的濃度有很大關(guān)系。Kong L[28]、Charles A[29]等實(shí)驗(yàn)證明DGAT 在肝臟中的過(guò)表達(dá)能使細(xì)胞溶質(zhì)中積累脂質(zhì)，并利用內(nèi)源性的單不飽和脂肪酸合成TG[30-31]。在我們的研究中檢測(cè)了各試驗(yàn)組細(xì)胞中DGAT 的mRNA 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)蘆丁能夠顯著抑制油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)DGAT1 和DGAT2 的基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制了OA 誘導(dǎo)的TG 的合成。

綜上所述，蘆丁能夠降低脂肪變性HepG2 細(xì)胞TG 含量，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上增加細(xì)胞內(nèi)PPAR-α的表達(dá)。并且能夠激活脂肪酸代謝途徑中CPT 的表達(dá)，同時(shí)抑制TG 合成過(guò)程途徑中DGAT 的表達(dá)。我們推測(cè)蘆丁是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)PPAR-α 的表達(dá)，恢復(fù)脂肪變性肝細(xì)胞中脂肪酸的正常氧化代謝、抑制脂肪酸的合成，進(jìn)而減緩OA 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中TG的積累。同時(shí)蘆丁通過(guò)抑制DGAT 的轉(zhuǎn)錄，減緩了脂肪變性感細(xì)胞中TG 過(guò)量的合成?？梢?，蘆丁對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響并不是單一的，可能涉及多種方式多條通路，具體機(jī)制還有待在后續(xù)的研究中闡明。

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