陳燕敏　袁武鋒　龐珍珍

[摘要] 目的 分析杭州地區(qū)乙肝病毒基因分型分布情況及與乙肝病毒DNA定量、乙肝兩對半定性/半定量、AFP定量各項指標間的聯(lián)系。 方法 對臨床146例乙肝病毒DNA陽性患者，用PCR 法進行乙肝病毒基因分型及乙肝病毒DNA定量檢測；用ELISA法進行乙型肝炎兩對半定量檢測；用夾心法進行AFP定量檢測，以分析彼此間的相關性。 結果 經統(tǒng)計，B型75例，占51.4%；C型62例，占42.5%；非B非C型共9例，占6.2%；男女性患者基因分型的構成比差異無統(tǒng)計學意義。C型乙肝病毒DNA水平明顯高于B型，C型乙肝表面抗原及E抗原定量測定值高于B型。C型患者AFP定量測定均值較B型高，但二者差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結論 杭州地區(qū)乙肝病毒基因型以B型為主，C型次之；C型乙肝病毒DNA含量較B型高，肝臟損害較B型嚴重。

[關鍵詞] 乙型肝炎；基因分型；乙肝臨床指標

[中圖分類號] R512.62 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）21-0097-04

[Abstract] Objective To study the distribution of HBV genotypes and the relationship between HBV genotypes and the clinical characteristics in Hangzhou area. Methods The genotype， content of HBV-DNA， serological indicators and AFP were detected by RT-PCR， time resolved immunofluorescence method respectively in 146 cases of HBV-DNA positive patients. The relationship between HBV genotype and the clinical characteristics were analyzed by the statistical analysis. Results In the HBV genotyping， there were 75 cases of type B （51.4%），62 cases of type C （42.5%），9 cases of no B or no C type （6.2%）；In type C， the HBV-DNA， HbsAg and HbeAg content were significantly higher than the type B. The content of AFP in type C was higher than type B， but with no statistical difference（P>0.05）. Conclusion In Hangzhou area， the priority genotype of HBV is type B. Genotype has a certain relationship with the clinical characteristics and the severity of the disease.

[Key words] Hepatitis B virus； Genotype； Clinical characteristics

乙型肝炎（hepatitis B virus，HBV）是我國發(fā)病率較高的疾病，現約有1.2億乙肝病毒攜帶者，現癥慢性乙型肝炎患者達2000多萬人，我國每年用于肝炎對癥治療的直接醫(yī)療費用超過500億人民幣。

HBV病毒是嗜肝DNA病毒，是引起急、慢性肝炎的主要病原體之一，可導致不同程度肝硬化及肝癌等。而乙肝病毒在宿主體內復制的過程中，會發(fā)生核苷酸的錯誤配對，致使同一病毒核苷酸序列不同的差異，并表現為不同的病毒基因型。目前，根據乙肝病毒S區(qū)基因序列差異≥4%或全基因核苷酸序列的異質性≥8%的特點，將乙肝病毒區(qū)分為A、B、C、D、E、F、G和H八種基因型[1，2]。大量研究表明乙肝病毒的基因型具有一定的地域分布特點，并且乙肝病毒的傳播方式、臨床疾病譜、預后判斷、疫苗預防及抗病毒治療效果與其關系密切。本研究采用實時熒光定量PCR熒光探針法對146例乙肝患者的標本進行基因分型測定及乙肝病毒DNA定量、乙肝兩對半定量、AFP定量的測定，分析杭州地區(qū)乙型肝炎病毒基因型的分布與各項檢測指標之間的聯(lián)系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選擇2013年1～10月就診于浙江省人民醫(yī)院的146例HBV感染者，均為門診就診或住院的杭州地區(qū)居民。診斷符合2000年全國病毒性肝炎會議制定的標準，入選病例均排除合并甲、丙、丁、戊型等其他肝炎病毒感染，且乙肝病毒DNA定量均為陽性。其中男108例，女38例，年齡11～78歲，平均（35.9±1.4）歲。

1.2 試劑與儀器

乙肝病毒基因分型及DNA定量檢測試劑來源于上海復星醫(yī)藥集團公司；乙肝兩對半定量檢測試劑來源于英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司；AFP定量試劑來源于羅氏診斷產品（上海）有限公司。所使用的儀器包括ABI7500全自動熒光實時定量PCR儀及羅氏E170。

1.3 觀察指標

觀察乙肝病毒感染者的基因分型，B型、C型和非B非C型乙肝病毒DNA定量及AFP定量、乙肝表面抗原及乙肝E抗原與乙肝病毒基因分型的相關性。

1.4 檢測方法

1.4.1 乙肝病毒基因分型和HBV-DNA定量檢測 采用實時熒光定量PCR法對乙肝病毒進行基因分型，并對患者的HBV-DNA進行定量檢測。

1.4.2 乙肝兩對半定量檢測 采用時間分辨熒光分析法進行乙型肝炎兩對半定量檢測，包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc五種指標。

1.4.3 AFP定量檢測 采用時間分辨熒光分析法對患者血清中AFP水平進行定量檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料采用成組設計t檢驗，不符合正態(tài)分布則用秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因分型測定結果

146例杭州地區(qū)的乙肝病毒感染者的基因分布為：B型75例，占51.4%，C型62例，占42.5%，非B非C型共9例，占6.2%，見表1。男女性患者基因分型的構成比差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.328，P>0.05）。

2.2 基因分型與乙肝病毒DNA定量測定

乙肝病毒DNA定量與乙肝病毒基因分型存在一定的相關性。對B型及C型的乙肝病毒DNA定量測定數據進行統(tǒng)計分析，得出杭州地區(qū)C型乙肝患者與B型比較，乙肝病毒DNA定量測定值差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），C型的乙肝病毒DNA定量測定均值較B型高，見表2。

2.3 基因分型與乙肝表面抗原定量測定

乙型兩對半定量檢測項目中，乙肝表面抗原、乙肝E抗原與乙肝病毒基因分型相關性較大。將B型與C型的乙肝表面抗原定量測定值分為>250 ng/mL和≤250 ng/mL兩組，進行計量統(tǒng)計分析。數據表明C型乙肝表面抗原定量測定值較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 基因分型與乙肝E抗原定量測定

對146例患者的乙肝E抗原定量測定值進行統(tǒng)計分析，得出杭州地區(qū)C型乙肝患者與B型比較，C型乙肝E抗原定量較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。選取乙肝E抗原的陽性率作統(tǒng)計分析，C型的乙肝E抗原陽性率較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

2.5基因分型與AFP定量測定

對已做過AFP檢測的146例乙肝病毒DNA陽性患者的受檢樣本進行秩和檢驗統(tǒng)計，其中B型47例，C型36例。結果顯示C型乙肝患者的AFP定量測定均值較B型高，但二者差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表6。

3 討論

在世界各地中，乙型肝炎病毒感染有著不同程度的流行。其中，不同地區(qū)的乙型肝炎病毒基因型差異非常明顯，不同國家和國內地區(qū)間流行程度的差異，除生活習慣、人體免疫遺傳特征等因素明顯相關外，其與乙型肝炎病毒本身的生物學基因型、血清亞型和基因變異等也呈一定程度的相關性。在不同的地理區(qū)域中，乙型肝炎病毒基因的分型呈不同的分布，在不同人種中的流行及傳播方式也存在很大差異。在我國，乙型肝炎病毒主要流行A、B、C、D四種HBV基因型，所占比例分別為1.2%、39.3%、50.2%及8.1%，且不同省份不同地區(qū)的基因型也存在較大的差異，北方地區(qū)以C型為主，約占81.6%；南方地區(qū)則以B型為主，C型則占很小一部分[3]。本研究統(tǒng)計146例乙肝病毒DNA定量陽性的受檢樣本的基因分型情況，結果顯示杭州地區(qū)乙肝基因型以B型為主，共75例，占51.4%；C型次之，共62例，占42.5%；非B非C型有9例，占6.2%。之前研究結果顯示江西萍鄉(xiāng)地區(qū)B型為優(yōu)勢基因型，占68.1%，C型占12.4%[4]；但廣東地區(qū)基因型以B型為主，C型次之[5]。本次統(tǒng)計結果與普遍報道的南方以感染B型乙肝病毒為主相符。

不同基因型的乙型肝炎病毒具有不同的致病性及流行特征，故了解患者乙肝病毒基因分型具有重要的臨床意義。本研究統(tǒng)計結果顯示杭州地區(qū)C型乙肝病毒DNA定量測定值較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示C型乙肝病毒DNA復制較活躍。目前認為，乙型肝炎發(fā)病機制中乙肝病毒的復制狀態(tài)與其基因型之間有無關系尚存在爭議，但乙肝病毒誘導的免疫反應及血清中高滴度的乙肝病毒是其發(fā)病危險因素之一[6]。有學者發(fā)現C型較B型高HBV-DNA血癥，認為可能是因為乙肝病毒DNA高復制水平的長期存在導致C型患者更為嚴重的肝臟炎癥活動和肝硬化發(fā)生率。但樊笑霞等[7]研究報道B、C型感染患者血清乙肝病毒DNA之間差異無統(tǒng)計學意義，盡管乙肝病毒的復制狀態(tài)與其基因型之間有無關系尚存在爭議，從以上研究我們認為C型乙肝病毒感染者在進入免疫清除期時乙肝病毒反復活動，持續(xù)造成肝臟組織損傷，轉歸與預后較B型差。

文獻[8]報道B型乙肝病毒較C型乙肝病毒更容易通過前C區(qū)變異誘導e 抗原的轉化，轉歸及預后較C型好。通過對146例患者乙肝兩對半的檢測顯示，C型乙肝表面抗原定量測定值較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；C型乙肝E抗原定量較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且乙肝E抗原陽性率C型較B型高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示C型乙肝病毒復制較活躍，易形成持續(xù)的病毒血癥，但不易發(fā)生e系統(tǒng)的血清轉換。

據研究顯示[9]，AFP約在83%的肝癌患者血清中升高，而在肝硬化等患者中亦可出現不同程度的升高。而有研究[10]發(fā)現C型乙肝感染者較B型更易發(fā)展至肝硬化等重癥肝病，炎癥程度更為嚴重，且與肝細胞肝癌的發(fā)生更為密切。故對146例乙肝病毒DNA陽性的患者中檢測過AFP定量的樣本進行統(tǒng)計，其中B型47例，C型36例。結果顯示C型乙肝患者AFP定量測定均值較B型高，但二者差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。該統(tǒng)計結果可能受標本量的影響，乙肝病毒基因分型結果與AFP定量值是否存在聯(lián)系，還需進一步統(tǒng)計研究。

大量研究表明，抗乙肝病毒的藥物治療，尤其是干擾素治療的臨床療效與HBV-DNA的定量水平有直接關聯(lián)，HBV-DNA 載量低則干擾素治療療效好，HBV-DNA 載量高則干擾素治療療效差[11-14]。本研究分析2013年杭州地區(qū)乙型肝炎病毒基因型的分布情況及與乙肝病毒DNA定量、乙肝兩對半定量和AFP定量各項指標的關系，結果對于了解本地區(qū)乙型肝炎病毒各基因型的特點做了初步的研究。由于不同乙肝病毒基因型之間的地理分布、分子生物學特征以及臨床轉歸不同[15-22]，深入研究乙肝病毒的基因型對于進一步明確乙肝病毒的分子流行病學特點、確定傳播關系、鑒別傳染源、闡明發(fā)病機制和臨床治療的療效等都具有重要意義。

[參考文獻]

[1] Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus：Clinical and diagnostic impact[J]. J Clin Virol，2005， 32（2）：102-112.

[2] Arauzruiz P，Na rder H，Robertson H，et al. Genotype H：A new Amerindian genotype of the hepatitis B virus revealed in central America[J]. J Genvirol，2002，83（Pt 8）：2059-2073.

[3] Wang Z，Liu Z，Zeng G，et al. A new intertype recombinant between genotypes C and D of hepatitis B virus identified in China[J]. J Gen Virol，2005，86（Pt 4）：985-990.

[4] 陳燕萍，羅娜，王長奇，等. 萍鄉(xiāng)地區(qū)乙肝病毒基因多態(tài)芯片酶聯(lián)分析基因分型檢測報告[J]. 中國醫(yī)師雜志，2007， 9（7）：971-972.

[5] 關玉娟，楊湛，唐小平，等. 廣東地區(qū)乙型肝炎病毒基因型研究[J]. 廣東醫(yī)學，2006，27（1）：63-65.

[6] 馮體玉，曾東梅. 梅州地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型與臨床指標的關系[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（15）：31-33.

[7] 樊笑霞，陳軍，徐麗萍，等. 上海地區(qū)不同類型乙肝患者HBV基因分型與DNA水平[J]. 山東醫(yī)藥，2009，49（21）：14-18.

[8] 張勇，石銘，綦盛麟，等. 乙肝病毒攜帶者病毒基因分型與C基因啟動子及前C區(qū)變異的相關性分析[J]. 中國實驗診斷學，2010，14（6）：929-930.

[9] 范公忍，鄔光惠，胡大榮，等. 腫瘤特異性生長因子測定在肝癌診斷中的應用及與AFP比較[J]. 癌癥，2001，20（2）：203-208.

[10] 戴晨陽，梁樹人，李順天，等. 乙型肝炎病毒基因B型和C型與臨床關系的研究[J]. 中國醫(yī)學檢驗雜志，2004， 5（5）：391-393.

[11] Firdaus R，Saha K，Biswas A，et al. Current molecular methods for the detection of hepatitis C virus in high risk group population：A systematic review[J]. World J Virol， 2015，4（1）：25-32.

[12] Webster DP，Klenerman P，Dusheiko GM，et al. Hepatitis C[J]. Lancet，2015，385（9973）：1124-1135.

[13] Seeger C，Mason WS. Molecular biology of hepatitis B virus infection[J]. Virology，2015，6822（15）：77-82.

[14] Rossi LM，Escobar-Gutierrez A，Rahal P，et al. Advanced molecular surveillance of hepatitis C virus[J]. Viruses，2015，7（3）：1153-1188.

[15] Papastergiou V，Karatapanis S. Current status and emerging challenges in the treatment of hepatitis C virus genotypes 4 to 6[J]. World J Clin Cases，2015，3（3）：210-220.

[16] Mukherjee R，Burns A，Rodden D，et al. Diagnosis and management of hepatitis C virus infection[J]. J Lab Autom，2015，2（3）：29-49.

[17] Enomoto M，Tamori A，Nishiguchi S，et al. Hepatitis B virus genotypes and response to antiviral therapy[J].Clin Lab，2006，3（2）：43-47.

[18] Sumi H，Yokosuka O，Seki N，et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver diseas[J]. Hepatology，2003，37（1）：19-26.

[19] Yajun S，Erhei D，Jin W，et al. Genotyping of hepatitis B virus（HBV）by oligonucleotides microarray[J]. Molecular and Cellular Probes，2006，20（2）：121-127.

[20] Wright TL. Introduction to chronic hepatitis B infection[J].Am J Gastroenterol，2006，101（Suppl 1）：S1-S6.

[21] Kao JH，Chen PJ，Lai MY，et al. Clinical and virological aspects of blood donors infected with hepatitis B virus genotypes B and C[J]. J Clin Microbiol，2002，40（1）：22- 25.

[22] Watanabe K，Takahashi T，Takahashi S，et al. Comparative study of genotype B and C hepatitis B virus induced chronic hepatitis in relation to the basic core promoter and precore mutations[J]. J Gastroenterol Hepatol，2005， 20（3）：441-449.

（收稿日期：2015-03-05）