谷倬宇，李 軍*，李思源，肖智偉，周 婷

(石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科； 2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.第一附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 新疆 石河子 832002)

?

研究論文

塞來昔布抑制人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的增殖、侵襲、遷移能力

谷倬宇1,2#，李 軍1,2#*，李思源2，肖智偉2，周 婷3

(石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科； 2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.第一附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 新疆 石河子 832002)

目的探討COX-2抑制劑塞來昔布對人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1增殖、侵襲、遷移能力的影響，確定塞來昔布作用的最佳濃度和最適宜的應(yīng)用時(shí)間。 方法不同濃度的塞來昔布(20、60和100 μmol/L)處理胰腺癌細(xì)胞不同時(shí)間(24、48和72 h)后，用MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖能力；用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力；采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。 結(jié)果MTT結(jié)果顯示塞來昔布作用后胰腺癌細(xì)胞的增殖能力下降，呈時(shí)間和濃度依賴性(P<0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示塞來昔布作用后胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力下降，呈濃度依賴性(P<0.01)；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示塞來昔布作用后胰腺癌細(xì)胞的遷移能力下降，呈濃度依賴性(P<0.01)。 結(jié)論塞來昔布以濃度梯度、時(shí)間梯度的形式減弱人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的增殖能力，以濃度梯度的形式減弱人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的侵襲及遷移能力。

胰腺癌; 塞來昔布; 增殖; 侵襲；遷移

選擇性COX-2抑制劑塞來昔布是臨床上常用的非甾體類抗炎藥物之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布具有抗腫瘤作用[1]，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[2-4]。胰腺癌惡性程度極高，侵襲和轉(zhuǎn)移是其最重要的生物學(xué)特征[5]。然而目前塞來昔布在胰腺癌中的作用尚未見報(bào)道，作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度COX-2抑制劑塞來昔布作用于人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，觀察其對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，旨在探討塞來昔布對胰腺癌的作用，確定塞來昔布的最佳作用濃度和最適宜的應(yīng)用時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)，塞來昔布(瑞輝公司)，Matrigel膠(BD公司)，Transwell侵襲小室(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理:PANC-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁增殖，每3天傳代1次，取對數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。塞來昔布溶于DMSO中，配成0.1 mmol/L濃度原液，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需要的濃度，并使DMSO終濃度<0.1%。實(shí)驗(yàn)分為溶劑對照組和藥物干預(yù)組。以0.1%終濃度的DMSO作為溶劑對照組。藥物干預(yù)組DMEM中塞來昔布終濃度分別為0、20、60和100 μmol/L。

1.2.2 MTT增殖實(shí)驗(yàn):調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為105/mL，每孔100 μL加入96孔板中，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，次日吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)基，分組方法同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中分別孵育24、48和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩后在酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取A值，空白孔調(diào)零，重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn):Matrigel用無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶5比例進(jìn)行稀釋后，75 μL/孔鋪于Transwell小室的上層濾膜上，37 ℃無菌保持過夜，待Matrigel形成膠后備用。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，上室加入200 μL含塞來昔布的DMEM，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，分組方法同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后取出上室，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，12孔板中加入0.1%結(jié)晶紫500 μL，將小室置于其中，30 min后取出鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野照相計(jì)數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)目來表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn):6孔板背后每隔0.8 cm劃一道橫線，每孔穿過3條線，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為105/mL鋪板，過夜鋪滿。次日用槍頭垂直于背后橫線劃痕，復(fù)制損傷模型，用PBS沖洗后加入培養(yǎng)液，分組方法同上，每組3個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中孵育。按0和24 h觀察取樣，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響

經(jīng)過不同濃度和不同處理時(shí)間，塞來昔布作用于PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力均不同程度地受到抑制，呈時(shí)間和濃度依賴性趨勢(P<0.05)(表1)。

2.2 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

正常PANC-1細(xì)胞呈梭形或多角形，少數(shù)呈類圓形，核大有分裂象，突起少而短。培養(yǎng)基中加入塞來昔布24 h后，與正常細(xì)胞比較，細(xì)胞變圓、縮小、老化，隨藥物濃度的升高，細(xì)胞的數(shù)目開始減少并開始出現(xiàn)死細(xì)胞(圖1)。

2.3 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞侵襲能力的影響

與對照組比較，塞來昔布作用于PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力逐漸下降，呈濃度依賴性趨勢(P<0.01)(圖2,表1)。

2.4 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響

與對照組比較，塞來昔布作用于PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞的遷移能力逐漸下降，呈濃度依賴性趨勢(P<0.01) (圖3,表1)。

表1 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

A.normal PANC-1 cell; B.60 μmol/L celecoxib group; C.100 μmol/L celecoxib group

圖3 塞來昔布對PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿、進(jìn)展迅速、預(yù)后極差，極易侵入周圍組織間隙而擴(kuò)散，形成侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。發(fā)達(dá)國家每年因患胰腺癌死亡人數(shù)高達(dá)2萬，中國的發(fā)病情況與國外類似，胰腺癌發(fā)病率與死亡率逐年增長[7- 8]。研究發(fā)現(xiàn)選擇性COX-2抑制劑的抗腫瘤機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期和影響腫瘤新生血管生成等[9- 11]，但COX-2抑制劑在胰腺癌細(xì)胞中的作用尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)首先測定了COX-2抑制劑塞來昔布對PANC-1細(xì)胞的體外增殖能力影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著塞來昔布濃度的增加，24、48和72 h后細(xì)胞生長的增殖率均逐漸降低，且該作用呈濃度依賴性，這與最新的文獻(xiàn)報(bào)道相近[12]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，48和72 h后塞來昔布對細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制，抑制率開始高于50%，因此侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)間要限定在24 h內(nèi)，以排除藥物對細(xì)胞增殖明顯抑制后細(xì)胞數(shù)目及狀態(tài)的干擾。侵襲結(jié)果提示，塞來昔布可以顯著地抑制細(xì)胞體外穿越基底膜的能力，減弱細(xì)胞向下室的趨化作用，使細(xì)胞的侵襲能力下降。劃痕結(jié)果同樣提示24 h后，細(xì)胞向劃痕中央遷移的速度明顯減慢，塞來昔布濃度越高，對細(xì)胞遷移能力的抑制作用越明顯，這與侵襲結(jié)果保持一致。以上結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖片提示當(dāng)塞來昔布濃度為100 μmol/L時(shí)其抗胰腺癌作用最為明顯，且呈濃度依賴性。

綜上所述，COX-2抑制劑塞來昔布以濃度梯度和時(shí)間梯度的形式減弱人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的增殖能力，以濃度梯度的形式減弱人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的侵襲及遷移能力，起到抗胰腺癌作用。對COX-2抑制劑的深入研究有利于進(jìn)一步揭示胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制并為新的抗胰腺癌藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

[1] Vosooghi M, Amini M. The discovery and development of cyclooxygenase-2 inhibitors as potential anticancer therapies[J]. Expert Opin Drug Discov, 2014,9:255- 267.

[2] Park SB, Jee BC, Kim SH,etal. Cyclooxygenase-2 Inhibitor, Celecoxib, Inhibits Leiomyoma Cell Proliferation Through the Nuclear Factor κB Pathway [J]. Reprod Sci, 2014,21:1187- 1195.

[3] Li WW, Long GX, Liu DB,etal. Cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib suppresses invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma cell lines through a decrease in matrix metalloproteinase-2 and -9 activity[J]. Pharmazie, 2014,69:132- 137.

[4] Zhang S, Da L, Yang X,etal. Celecoxib potentially inhibits metastasis of lung cancer promoted by surgery in mice, via suppression of the PGE2-modulated beta-catenin pathway[J]. Toxicol Lett, 2014,225:201 -207.

[5] Mihaljevic AL, Michalski CW, Friess H,etal. Molecular mechanism of pancreatic cancer—understanding proliferation, invasion, and metastasis[J]. Langenbecks Arch Surg, 2010,395:295- 308.

[6] 楊 紅,錢家鳴,張惠廣,等. 胰腺癌300例臨床特點(diǎn)分析[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,27:815- 818.

[7] Chen WQ, Liang D, Zhang SW,etal. Pancreatic cancer incidence and mortality patterns in china, 2009[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14:7321- 7324.

[8] Long J, Luo GP, Xiao ZW,etal. Cancer statistics: current diagnosis and treatment of pancreatic cancer in Shanghai, China[J]. Cancer Lett, 2014,346:273- 277.

[9] Sadeghi-Aliabadi H, Aliasgharluo M, Fattahi A,etal.Invitrocytotoxic evaluation of some synthesized COX-2 inhibitor derivatives against a panel of human cancer cell lines[J]. Res Pharm Sci, 2013,8:298- 303.

[10] Wang ZL, Fan ZQ, Jiang HD,etal. Selective COX-2 inhibitor celecoxib induces epithelial-mesenchymal transition in human lung cancer cells via activating MEK-ERK signaling[J]. Carcinogenesis, 2013,34:638- 646.

[11] 白小燕,牟曉燕,姜淑娟,等. 厄羅替尼聯(lián)合塞來昔布阻斷EGFR和COX-2抑制肺癌A549細(xì)胞增殖[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,31:19- 24.

[12] Ding N, Cui XX, Gao Z,etal. A triple combination of atorvastatin, celecoxib and tipifarnib strongly inhibits pancreatic cancer cells and xenograft pancreatic tumors[J]. Int J Oncol,2014,44:2139- 2145.

Celecoxib inhibits proliferation, invasion and migration of human pancreatic cancer cell line PANC-1invitro

GU Zhuo-yu1,2#，LI Jun1,2#*，LI Si-yuan2，XIAO Zhi-wei2，ZHOU Ting3

(1.Dept. of Endocrinology and Metabolism, First Affiliated Hospital; 2.Key Laboratory of Ministry of Education, Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases; 3.the Central Laboratory, First Affiliated Hospital, Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832002, China)

Objective To investigate the effects of cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib on proliferation, invasion and migration of human pancreatic cancer cell line PANC-1 and then determine the optimal concentration of celecoxib and the most suitable application time. Methods Human pancreatic cancer cell line PANC-1 was treated with diverse concentrations of celecoxib (20,60,100 μmol/L) for different durations (24,48,72 h). Cell proliferation, invasion and migration capabilities were measured by MTT colorimetry, Transwell invasion assay, and scratch assay respectively. Results The proliferation capability of PANC-1 cell was reduced by celecoxib in a concentration- and time-dependent manner (P<0.05). In addition, the invasion and migration capabilities were decreased by celecoxib in a concentration-dependent manner(P<0.01). Conclusions Celecoxib attenuates the

proliferation of human pancreatic cancer cell line PANC-1 in a concentration- and time-dependent manner. Celecoxib attenuates the invasion and migration in a concentration-dependent manner.

pancreatic cancer; celecoxib; proliferation; invasion; migration

2014- 08- 14

2014- 11- 22

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)國際合作基金(2011BC005);新疆研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(XJGRI2014063)

1001-6325(2015)01-0065-04

R735.9

A

*通信作者(corresponding author)：xjlijun@163.com

#對本文研究有相同貢獻(xiàn)