張尤歷，王國英，趙 義，李 萍，劉 鑫，倪 鑫，徐 岷

(江蘇大學 附屬醫(yī)院 消化內科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

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研究論文

上調miR- 200a的表達減弱TGF-β1刺激的大鼠胰腺星狀細胞活化和膠原合成

張尤歷，王國英，趙 義，李 萍，劉 鑫，倪 鑫，徐 岷*

(江蘇大學 附屬醫(yī)院 消化內科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

目的探討miR- 200a對轉化生長因子β1(TGF-β1)刺激的大鼠胰腺星狀細胞(PSCs)活化和膠原蛋白合成的影響。方法用組織塊法培養(yǎng)分離PSCs，免疫熒光染色檢測結蛋白(desmin)、神經(jīng)膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達鑒定PSCs；取新鮮培養(yǎng)的第2代PSCs，設空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+miR- NC組、TGF-β1+miR- 200a mimic組，Western blot法和細胞免疫熒光染色法檢測α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)的表達，熒光定量PCR檢測α-SMA、collagen Ⅰ mRNA及miR- 200a的表達。結果TGF-β1可刺激大鼠PSCs活化及促進膠原蛋白的合成(P<0.05)，且呈時間依賴性；轉染miR- 200a mimic后，在相同濃度的TGF-β1刺激下，α-SMA和collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表達明顯降低(P<0.01)。結論上調miR- 200a的表達，可減弱TGF-β1對大鼠PSCs活化和膠原蛋白合成的刺激作用，其可能的機制是抑制TGF-β1的生物學作用。

TGF-β1；PSCs；miR- 200a；纖維化

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)主要的病理學改變是胰腺組織纖維化和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)異常沉積[1]。胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)是纖維化過程中主要的始動和效應細胞。正常情況下，PSCs呈靜息狀態(tài)；當胰腺受到刺激時，PSCs可活化為肌成纖維樣細胞，失去維生素A脂滴，表達特異性標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)，合成大量ECM，主要有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，Ⅲ)和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等[2]。

MicroRNA(miRNA)通過調節(jié)靶基因調控一系列細胞功能，如增殖、分化和致癌等[3- 4]。研究表明miR- 200a在器官纖維化中起了重要作用，但是在胰腺纖維化中的作用尚不清楚[5]。本研究旨在探討miRNA- 200a對TGF-β1刺激的大鼠PSCs活化和膠原合成的影響，為胰腺纖維化的基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級SD雄性大鼠(江蘇大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk(蘇)2013- 0011)，體質量200～250 g，實驗前12 h禁食，自由飲水。

1.1.2 試劑：重組TGF-β1(Pepro Tech公司)，神經(jīng)膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、結蛋白(desmin)、α-SMA和collagen Ⅰ單克隆抗體(Abcam公司)，HRP標記的二抗和Cy3標記的熒光二抗(北京康為世紀生物公司)，miR- 200a mimic(廣州銳博生物公司)。

1.2 組織塊貼壁培養(yǎng)分離PSCs

腹腔注入苯巴比妥鈉麻醉大鼠，75%乙醇消毒后超凈臺內快速分離出胰腺組織，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，加入培養(yǎng)基均勻接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后更換新的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后有細胞爬出，5～7 d細胞開始快速增殖，進行傳代，取第2代PSCs作為研究對象。

1.3 細胞轉染

轉染前1天，接種1×105/孔的PSCs至6孔板中，加入不含抗生素的培養(yǎng)基，用LipofectamineTM2000介導轉染。轉染方法按照說明書進行，miR- NC及miR- 200a mimic用量(50 nmol/L)為推薦的最適濃度。轉染72 h后觀察轉染率及細胞形態(tài)，并收集細胞備用。

1.4 免疫熒光染色法鑒定PSCs及檢測α-SMA和collagen Ⅰ蛋白表達

將細胞接種于24孔板(1×103個/孔)，貼壁后4%多聚甲醛4 ℃固定過夜， 0.3% TritonX- 100作用8 min，加3% BSA 37 ℃孵育1 h，一抗4 ℃過夜，熒光標記二抗37 ℃孵育1 h，核熒光染色37 ℃ 30 min，甘油封片熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測α-SMA和collagen Ⅰ蛋白表達

取對數(shù)增殖期PSCs以3×105個接種于培養(yǎng)瓶中，貼壁后加入TGF-β1使其終濃度為10 μg/L。分別作用24、48和72 h后收集細胞總蛋白，BCA法定量，各取等量樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉2 h，一抗(α-SMA 抗體1∶1 000稀釋、collagen Ⅰ抗體1∶500稀釋，β-actin抗體1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃溫箱孵育1 h， ECL化學發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析處理，取各目的蛋白與內參照吸光度的比值作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.6 熒光定量PCR檢測α-SMA、collagenⅠ mRNA和miR- 200a的表達量

按照Trizol試劑說明書提取各組細胞的總RNA，合成cDNA，進行熒光定量PCR。目的基因α-SMA、collagen Ⅰ和內參基因β-actin引物(表1)由上海生物工程公司設計合成。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。miR- 200a及內參U6引物由廣州銳博生物公司設計合成。反應條件為：95 ℃預變性20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。所有數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，實驗重復3次。

表1 定量PCR引物

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠PSCs的鑒定

新鮮分離的PSCs在倒置顯微鏡下觀察向四周伸出突起，呈星形或不規(guī)則狀，細胞系與質比例較大，可見到貯脂顆粒，接種72 h后細胞星形外觀最明顯，1周后體積變大，約60%～70%匯合，脂滴基本消失(圖1)。免疫熒光染色后鏡下觀察約90%的細胞陽性表達Desmin和GFAP，而α-SMA幾乎不表達(圖2)。

2.2 PSCs中 α-SMA和collagen Ⅰ的差異表達

與空白對照組相比，TGF-β1刺激24、48和72 h后，PSCs中α-SMA和collagen Ⅰ蛋白表達量隨著刺激時間的延長逐漸增多(圖3A)； TGF-β1刺激72 h后，α-SMA、collagen ⅠmRNA表達量顯著高于對照組(圖3B)。

A,B,C.represent the form of PSCs cultured after 1, 3, 7 days

A, B, C.represent the expression of α-SMA; D, E, F.represent the expression of desmin; G, H, I. represent the expression of GFAP, results of each were presented with Hoechst33342 labeled blue fluorescence, Cy3 labeled red fluorescence and blue-red merged fluorescence

圖2 免疫熒光染色檢測α-SMA、Desmin、GFAP的表達鑒定PSCs

Fig 2 PSCs were identified by testing α-SMA, Desmin and GFAP with immunofluorescence(×100)

2.3 熒光定量PCR檢測PSCs中miR- 200a的表達

TGF-β1組中，miR- 200a的相對表達量為0.24±0.03，顯著低于對照組(P<0.001)。

2.4 miR- 200a 對α-SMA和collagen Ⅰ表達的影響

由于TGF-β1組中miR- 200a表達量較低，因此將miR- 200a mimic轉入細胞中，使miR- 200a過表達，同時檢測α-SMA 和collagen Ⅰ的表達。Western blot和熒光定量PCR結果都顯示miR- NC+TGF-β1組α-SMA和collagen Ⅰ mRNA及蛋白的表達與TGF-β1組無明顯變化；過表達miR- 200a組，兩者的相對表達量較miR- NC組明顯減少(P<0.01)(圖4)(表2，3)，免疫熒光染色結果與上述結果一致(圖5)。

3 討論

慢性胰腺炎是由多因素引起的胰腺組織結構和功能持續(xù)進行性損害，典型病理改變?yōu)橐认賹嵸|纖維化、腺泡萎縮、炎性細胞浸潤，而胰腺纖維化的主要特征是大量成纖維細胞增生和ECM沉積，其發(fā)生機制是目前研究的熱點之一。近年來大量研究揭示PSCs在胰腺纖維化的進程中具有重要作用，是多種誘因作用的靶點。正常胰腺組織內星狀細胞呈靜止狀態(tài)，無促纖維化作用，胰腺損傷時各種刺激因子如氧化應激、細胞因子或基因表達調控等使其激活[6]。TGF-β1是急慢性胰腺炎中刺激PSCs活化的重要細胞因子，可刺激膠原蛋白的合成[6- 7]。雨蛙肽誘導的胰腺炎小鼠模型中TGF-β1 mRNA和蛋白的表達與Ⅰ型、Ⅲ型膠原的mRNA增加水平相平行[8]。本研究通過組織塊法提取、體外培養(yǎng)大鼠PSCs，免疫熒光染色鑒定PSCs，TGF-β1刺激細胞，光鏡下觀察其形態(tài)學改變，Western blot和熒光定量PCR結果檢測α-SMA、collagen Ⅰ蛋白及基因的表達量，發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進大鼠PSCs活化和ECM的合成。

A.the expressions of α-SMA and collagen Ⅰ protein in PSCs after TGF-β1 treating for 24, 48 and 72 hours; B.the expressions of α-SMA and collagen Ⅰ mRNA in PSCs after TGF-β1 treating for 72 hours;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

圖3 TGF-β1對PSCs活化及膠原蛋白合成的影響

Fig 3 Effect of TGF-β1 on activation and collagen synthesis of PSCs

After transfection of miR- 200a mimic; A.the expressions of α-SMA and collagen Ⅰ protein in PSCs detected by Western blot; B.the expressions of α-SMA and collagen Ⅰ mRNA in PSCs measured by RT-qPCR;*P<0.01 compared with TGF-β1+miR-NC group

圖4 過表達miR- 200a 對TGF-β1引起的PSCs活化和膠原合成的影響

*P<0.001 compared with TGF-β1+miR- NC group.

表3 過表達miR- 200a 后α-SMA和collagen ⅠmRNA的相對表達量

*P<0.01 compared with TGF-β1+miR- NC group.

A, B, C, G, H, I.represent the expression of α-SMA and collagen Ⅰ after TGF-β1 treating; D, E, F, I, K, L.represent the expression of α-SMA and collagen Ⅰ after transfection of miR- 200a mimic, results of each group were presented with Hoechst33342 labeled blue fluorescence, Cy3 labeled red fluorescence and blue-red merged fluorescence

圖5 過表達miR- 200a 對PSCs活化和膠原合成的影響

Fig 5 Effect of miR- 200a on activation and collagen secretion of PSCs(Scale bar=100 μm)

MicroRNA是一種具有調控功能的非編碼RNA，通過降解靶mRNA或者阻遏其翻譯來調控靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)在肺纖維化過程中miR- 200家族成員miR- 200a、miR- 200b、miR- 200c的表達顯著下降，而上調miR- 200a、miR- 200b、miR- 200c可反轉TGF-β1誘導的肺泡細胞EMT[9]；在TGF-β1誘導活化的HSCs中，內源性miR- 200a的表達是下降的，過表達miR- 200a可以顯著抑制α-SMA的活力以及活化HSCs的增殖[10]；本研究通過轉染miR- 200a mimic后，顯著減輕了TGF-β1誘導的大鼠PSCs的活化和ECM的合成，提示miR- 200a能影響TGF-β信號通路進而觸發(fā)一系列生物學改變。

綜上所述：TGF-β1在PSCs活化，促進ECM的合成，抑制ECM降解過程中發(fā)揮了重要作用；本研究通過上調miR- 200a的表達，可明顯抑制TGF-β1引起的PSCs的活化和 ECM的合成。根據(jù)已有研究及本研究結果推測其機制至少是miR- 200a通過調控TGF-β1的生物學作用而實現(xiàn)，提示miR- 200a是慢性胰腺炎胰腺纖維化基因治療的潛在靶點。但由于一個miRNA可以調控數(shù)十乃至上千的基因，故深入研究TGF-β1在PSCs活化和致胰腺纖維化過程中的分子機制以及miR- 200a通過調控哪些關鍵信號通路和靶基因起作用，可為胰腺纖維化提供新的基因治療靶點。

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Up-regulation of miR- 200a attenuates TGF-β1-induced activation and collagen synthesis in rat pancreatic stellate cells

ZHANG You-li, WANG Guo-ying, ZHAO Yi, LI Ping, LIU Xin, NI Xin, XU Min*

(Dept. of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, China)

Objective To investigate the effect of miR- 200a mimic on transforming growth factor β1-mediated activation and collagen secretion of rat pancreatic stellate cells. Methods PSCs were isolated and cultured from pancreatic tissue and identified by desmin, GFAP and α-SMA immunofluorescence staining. PSCs of 2nd generation were divided into control group, TGF-β1 group, TGF-β1+miR- NC group and TGF-β1+miR- 200a mimic group. α-SMA and collagen Ⅰ protein were measured by Western blot and immunofluorescence staining. The mRNA of α-SMA and collagen Ⅰ and the expression of miR- 200a were detected by quantitative real-time PCR. ResultsTGF-β1 stimulates the activation of PSCs and promote collagen synthesis in time-dependment manner (P<0.05). After transfection of the mimic, treating with the same concentration of TGF-β1, the expressions of protein and mRNA of both α-SMA and collagen Ⅰ decreases significantly (P<0.01). Conclusions Over-expression of miR- 200a significantly attenuates α-SMA activity and further affects the collagen synthesis of TGF-β1-dependent activation of PSCs. The mechanisms are potentially related to the biological effects of TGF-β1.

TGF-β1; PSCs; miR- 200a; fibrosis

2014- 05- 15

2014- 08- 25

江蘇省自然科學基金(BK2013247)；鎮(zhèn)江市“169四期工程”科研項目[鎮(zhèn)人才辦(2013)19號]

1001-6325(2015)01-0048-06

R576

A

*通信作者(corresponding author)：peterxu1974@163.com