呂鐵偉，孫慧超，劉玲娟，張 蕾，鄭 敏，朱 靜，劉振國，田 杰

(重慶醫(yī)科大學 兒童醫(yī)院 1.心血管內科; 2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室,兒科學重慶市重點實驗室 重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地, 重慶 400014;3.美國俄亥俄州立大學 醫(yī)學中心 心肺研究所,Columbus Ohio 43210)

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研究論文

ox-LDL抑制大鼠MSCs向內皮分化

呂鐵偉1*，孫慧超1，劉玲娟2，張 蕾1，鄭 敏1，朱 靜2，劉振國3，田 杰1

(重慶醫(yī)科大學 兒童醫(yī)院 1.心血管內科; 2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室,兒科學重慶市重點實驗室 重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地, 重慶 400014;3.美國俄亥俄州立大學 醫(yī)學中心 心肺研究所,Columbus Ohio 43210)

目的觀察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)對大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)內皮分化的影響及其機制。 方法將可內皮分化的MSCs分為對照組(不加任何干預因素)，ox-LDL組(加入5 μg/mL的ox-LDL)，ox-LDL+乙酰半胱氨酸組(n-acetylcycteine，NAC)預處理后再加等濃度ox-LDL), nLDL對照組(加入5 μg/mL的天然低密度脂蛋白(native LDL，nLDL)。光鏡下觀察細胞形態(tài)，免疫組化、Western blot及RT-PCR技術檢測特異性內皮表面標記，流式細胞技術檢測分化效率，電子順磁振蕩技術檢測氧化活性產物(reactive oxygen species，ROS)，Western blot技術測定細胞信號通道蛋白Akt。結果1) MSCs能夠分化為內皮細胞，表現(xiàn)為內皮表面標志vWF、Flk- 1和CD31的出現(xiàn)和血管樣結構的形成； 2)ox-LD明顯減弱MSCs向內皮分化(P<0.05)，而NAC預處理后MSCs內皮分化能力恢復；3)ox-LDL干預后ROS明顯升高(P<0.05)，而NAC預處理后ROS產量明顯降低(P<0.05)；4)ox-LDL干預后磷酸化Akt表達明顯降低(P<0.01)，而NAC預處理后有所恢復，但仍低于正常培養(yǎng)組。結論ox-LDL抑制大鼠MSCs向內皮分化，NAC可部分或完全反轉ox-LDL的抑制效應,Akt發(fā)揮一定作用。

氧化低密度脂蛋白；骨髓間充質干細胞；內皮細胞；分化

大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)能夠分化為成熟內皮細胞[1], 其可作為以內皮受損或功能失調為基礎的動脈粥樣硬化和冠心病等疾病的種子細胞，而氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)是導致動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生發(fā)展的重要因素，Oct- 4是公認的干細胞表面標記，能夠維持干細胞的自我更新且在干細胞定向分化過程中逐漸減弱甚至消失[2]。本研究曾報道[3]ox-LDL抑制MSCs在體外培養(yǎng)過程中的增殖，并減弱其表面標志Oct- 4的表達。本研究進一步觀察ox-LDL能否影響MSCs的內皮分化，并從氧化應激水平及細胞信號通路探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

MSCs(俄亥俄州立大學醫(yī)學中心劉振國實驗室提供)，細胞培養(yǎng)體系包括DMEM/low glucose培養(yǎng)基(Gibco公司)、MCDB、 ITS、LA- BSA、L-ascorbic acid和EGF(Sigma公司)、 PDGF(R&D Systems公司)、 β-Mercaptoethanol(Fisher公司)、LIF(Esgro公司)和青/鏈霉素(Cellgro公司), Western blot、RT-PCR、免疫組化、流式細胞等技術檢測的Oct- 4、vWF、Flk- 1、CD31及相關試劑(Cell signaling公司)，ox-LDL及nLDL(俄亥俄州立大學醫(yī)學中心Sam’s實驗室)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs分組：采用培養(yǎng)3～4代的MSCs進行體外內皮分化實驗，分化培養(yǎng)基加上終濃度為10 ng/mL的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)為基本分化條件，將MSCs分為4組：對照組，MSCs置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不加任何干預因素；ox-LDL組，在分化培養(yǎng)基中加入5 μg/mL的ox-LDL；ox-LDL+NAC組，抗氧化劑乙酰半胱氨酸 (N-acetylcycteine，NAC) 預處理培養(yǎng)體系后再加入等濃度ox-LDL； nLDL對照組，在培養(yǎng)基中加入5 μg/mL的nLDL (native-LDL)；本實驗將MSCs以2 000～4 000/cm2的密度接種于玻璃培養(yǎng)皿和24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、 5% CO2和5% O2的孵箱中培養(yǎng)，整個細胞分化的過程均不傳代，每48 h換液，同時加入同濃度和體積的誘導劑VEGF和干預試劑，在分化第2周提取細胞蛋白和總RNA，檢測各自的濃度后置于-80 ℃低溫冰箱備用，每實驗組的樣本量至少3個。

1.2.2 血管結構形成的檢測：采用集成生長因子的基質膠(matrigel)3D培養(yǎng)方式，觀察MAPCs在內皮分化過程中血管結構的形成?；|膠在4 ℃時處于液體狀態(tài)，但在常溫下能迅速形成凝膠樣三維結構，有利于細胞的空間生長；首先將液態(tài)的基質膠按照150～200 μL/接種表面積(cm2)的體積轉移到預先4 ℃保存的玻璃培養(yǎng)皿中，然后把培養(yǎng)皿放入37 ℃孵箱中30 min，加入培養(yǎng)基再接種不同實驗組的細胞培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，并拍照記錄。

1.2.3 Western blot檢測vWF、Flk- 1和CD31蛋白表達：在體外誘導分化的第2周，收集各組細胞提取蛋白并檢測濃度，按照試劑盒步驟對各組細胞內皮特異性標記vWF、Flk- 1和CD31蛋白進行檢測，采用凝膠圖形分析軟件對Western blot的特異性條帶進行灰度掃描和定量分析。蛋白的吸光度值用內參GAPDH進行校正。

1.2.4 Real time-PCR檢測vWF、Flk- 1和CD31 mRNA表達：體外誘導分化的第2周收集各組細胞，抽提總RNA、檢測純度及濃度，反轉錄后按試劑盒步驟進行PCR反應。反應體系為：熒光染料SYBR Green 6 μL，引物(包括等體積的上游和下游引物)1 μL，cDNA 1 μL，去離子水4 μL，混勻后加入96孔反應板中，每個待測基因至少點樣2孔以上，以GAPDH基因作為內參；反應參數(shù)為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s×40循環(huán)；最后95 ℃ 5 min，58 ℃ 10 min；反應完成后，讀出每孔待測樣本的CT值，求平均數(shù)，并以GAPDH的CT值作內參，采用公式：擴增產物倍數(shù)=2-△△CT計算出mRNA量的改變并進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 熒光免疫組化檢測vWF、Flk- 1和CD31的表達：將細胞培養(yǎng)在玻片培養(yǎng)室(Chamber slides)中，細胞接種前用纖維黏連蛋白(fibronectin, FN)處理玻片；在誘導分化的第2周，常規(guī)處理待測細胞，4%多聚甲醛固定及5%山羊血清封閉，加入濃度為1∶200的血管性血友病因子 (von Willebrand factor, Vwf)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor 2，F(xiàn)lk- 1)和血小板-內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)一抗4 ℃；孵育過夜，然后加入FITC標記的種屬相對應的二抗(1∶200)室溫下孵育1 h，最后加入DAPI孵育進行細胞系標記，每實驗組中以只加二抗作為陰性對照；最后除去載玻片上黏附的玻璃分隔，甘油封片置于共聚焦顯微鏡下觀察實驗結果。

1.2.6 流式細胞技術檢測內皮分化能力：在內皮分化的第2周，以vWF為表面標記，用流式細胞技術檢測vWF陽性表達細胞。首先收集細胞制成(1～5)×106個/mL的細胞懸液，加入0.1% 穿孔素(trixon-X)進行細胞打孔20 min，離心棄去上清液后用正常羊血清封閉20 min，然后1∶200的vWF孵育30 min，再二抗孵育20 min，最后加入5%多聚甲醛等待上機檢測，每個標本應該重復檢測3次，結果采用flowJ軟件進行處理和統(tǒng)計分析。

1.2.7 氧化活性產物ROS的檢測：采用電子順磁振蕩技術(electron paramagnetic resonance，EPR)檢測ROS含量。首先收集細胞計數(shù)，使細胞濃度達到107/mL，每個樣本中抽取100 μL細胞懸液加入EPR微小玻璃吸管中，再置于EPR儀器進行檢測，每個樣本重復3次測定，描繪各組的EPR信號，統(tǒng)計EPR信號強度并進行對比。

1.2.8 細胞信號通道蛋白的檢測：用蛋白印跡技術檢測信號通道蛋白Akt的表達。在MAPCs內皮分化的第2周，收集4組別的細胞，提取蛋白測定濃度，按照實驗步驟采用Western blot技術完成對Akt及磷酸化Akt(Akt的活性狀態(tài))的檢測，實驗結果采用ImageJ圖像軟件和SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析得出結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血管結構的形成

在分化的第2周，正常分化的MSCs(control組)在matrigel三維培養(yǎng)體系中觀察到血管結構的形成(圖1A)，而ox-LDL組則沒有血管結構的出現(xiàn)(圖1B)，但經過NAC預處理后再加入ox-LDL干預的MSCs(NAC+ ox-LDL組)在分化的第2周消失的血管結構重新出現(xiàn)(圖1C)。

A.control group；B.ox-LDL group; C.ox-LDL+NAC group

2.2 vWF、Flk- 1 及CD31的免疫組化變化

在分化的第2周，ox-LDL干預后與對照組相比vWF、Flk- 1和CD31表達減弱，而NAC預處理后三者表達恢復到接近正常(undifferentiated表示未進行誘導分化的MSCs，圖2)。

2.3 ox-LDL對vWF、Flk- 1、CD31蛋白及mRNA表達的影響

在分化的第2周，ox-LDL明顯減弱vWF、Flk- 1和CD31蛋白表達，分別是正常組水平的17%、25%和42%(P<0.05)，而NAC預處理后3種蛋白的表達量恢復到接近正常組(圖3，表1)；在分化的第2周，ox-LDL明顯降低vWF、Flk- 1和CD31 mRNA表達，分別是正常組水平的12%、15%和8%(P<0.05)，同樣經NAC預處理后三者的表達水平接近正常組(表1)。

2.4 不同干預因素下各組內皮分化效率及Akt的變化

在分化的第2周， 與同期培養(yǎng)未分化的MSCs相相比，大約有43%的MSCs出現(xiàn)vWF的陽性表達(圖4A)，ox-LDL干預組約有8%的MSCs出現(xiàn)vWF的陽性表達(圖4B)，而NAC預處理組vWF的陽性表達明顯恢復，陽性表達率約為38%(圖4C)； 在分化的第2周，三實驗組t-Akt的表達無差異，而p-Akt在對照組表達最強，ox-LDL組無表達，NAC+ox-LDL組有弱表達，但其表達與對照組相比具有明顯差別(P<0.05)(圖5)。

A.unidifferentiated cell； B.control group； C.ox-LDL group； D.ox-LDL+ NAC group

圖3 Western blot技術檢測不同組別vWF、Flk- 1和CD31蛋白表達

groupvWFFlk?1CD31mRNAproteinmRNAproteinmRNAproteincontrol839±039060±004635±025068±0071168±051098±011ox?LDL100±020?014±002?100±012?016±010?100±020?047±010?NAC+ox?LDL771±035052±004537±024063±0081076±045082±019

*P<0.05 compared with control group.

2.5 氧化活性產物ROS的變化

正常培養(yǎng)的MSCs未見典型EPR信號(圖6A a)，但ox-LDL干預后則出現(xiàn)典型的EPR信號(圖6A b)，NAC預處理后同樣未見EPR信號(圖6A c)；在細胞培養(yǎng)體系中ROS的產生呈時間依賴性，在ox-LDL干預的第60s信號表達至高峰，以后穩(wěn)定維持在這一水平(圖6B)；加入ox-LDL的濃度越高，ROS產生量越大，NAC預處理后ROS的產生明顯受到抑制(圖6C)，而nLDL組未出現(xiàn)EPR信號。

3 討論

內皮受損或功能失調是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，該類患者體內EPCs的數(shù)量明顯減少、功能顯著下降[4- 5]，不足以替代受損的內皮功能，因此，外源細胞的內皮重建成為該類疾病根治的必然選擇，MSCs被證明能夠誘導分化為內皮細胞而成為研究熱點[6]。

ox-LDL是重要的動脈粥樣硬化致病因子之一，能夠導致血管內皮功能障礙，其發(fā)生可能與抑制細胞遷移、黏附和血管發(fā)生有關[7]，筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)ox-LDL能夠抑制MSCs在體外培養(yǎng)過程中的增殖，并減弱其表面標志Oct- 4的表達[3]，而ox-LDL能否影響MSCs的內皮分化更關系到MSCs源性內皮重建的效能，本結果顯示在MSCs內皮分化的過程中加入ox-LDL，內皮特異性表面標記表達明顯減弱、沒有內皮特征性的血管結構形成且內皮分化的效率明顯降低。

A.about 43% MSCs appeared positive-expression-vWF after 2 weeks of differentiation, compared with Undifferentiated MSCs; B.only 8% MSCs appeared positive-expression-vWF in ox-LDL groups; C.38% MSCs appeared positive-expression-vWF in NAC+ox-LDL groups

圖4 流式細胞儀檢測不同組別MSCs陽性表達的vWF

Fig 4 Flow cytometry analysis of endothelial-specific marker vWF positive-expression after 2 weeks of

differentiation of MSCs

Outcome of t-Akt and p-Akt at different groups afer 2nd week of differentiation by WB；*P<0.05 compared with control groups；**P<0.01compared with control groups

圖5 不同實驗組細胞信號通道蛋白Akt的表達

Fig 5 Expression of Akt protein in different groups

A：a.there was no signal of ROS in control groups by EPR, b.typical ROS signal appeared in ox-LDL group, c.ROS signal disappeared in NAC+ox-LDL group;B：a.significant amount of ROS was generated from ox-LDL group in a time-dependent manner; C:generation of ROS is in dose-dependent manner,but ROS was inhibited after addition of NAC to culture system;*P<0.05 compared with control groups；**P<0.01 compared with ox-LDL group; cell+OX5 means MSCs cultured with 5 μg/mL ox-LDL; cells+OX10 means MSCs cultured with 10 μg/mL ox-LDL

圖6 電子順磁震蕩技術檢測不同組別活性氧產物ROS的形成

Fig 6 ROS formation in different groups by electron paramagnetic resonance (EPR)

本實驗發(fā)現(xiàn)nLDL沒有出現(xiàn)ox-LDL類似的內皮抑制作用，而ox-LDL是nLDL經氧化修飾得到的，因此從該角度進行機制的研究。大量研究報道，氧化應激存在于上述心血管疾病的整個病理生理過程中，是ox-LDL各種生物學行為的啟動機制，活性氧化產物(reactive oxygen species，ROS)直接調控生物體內的氧化還原平衡狀態(tài)，后者與機體氧化應激和心血管疾病發(fā)生發(fā)展相關[8]。本實驗檢測到ox-LDL干預后有大量ROS的產生，而正常培養(yǎng)和nLDL干預組卻沒有檢測到ROS，抗氧化劑NAC預處理能夠完全阻止ROS的產生從而有效地反轉ox-LDL對MAPCs的抑制作用，提示ox-LDL通過ROS的產生抑制MAPCs的內皮方向分化。

文獻報道PI3/Akt信號通路參與了ox-LDL對MAPCs的作用[9]，本實驗發(fā)現(xiàn)3組總Akt(t-Akt)的表達量無差異，而具有活性作用的磷酸化Akt(p-Akt)在對照組表達最強，說明Akt蛋白在ox-LDL抑制MSCs內皮分化的過程中發(fā)揮一定作用，本實驗顯示ox-LDL對Akt磷酸化的抑制作用僅僅能被NAC輕度反轉，提示ox-LDL對MAPCs的抑制作用是通過多種途徑完成的，其中包括氧化應激、Akt和其他信號通道蛋白[10]等。

綜上所述，ox-LDL來源的ROS形成在ox-LDL對MAPCs增殖和內皮分化抑制作用機制中占重要地位，同時Akt信號通道也參與此過程，該結果對冠心病和動脈粥樣硬化等心血管疾病的細胞治療提供了一定的實驗依據(jù)。

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科普沙龍

阻斷CCL2的抑制作用可通過促進血管生成加速乳腺癌轉移

科學家們發(fā)現(xiàn)，乳腺腫瘤所分泌的C-C趨化因子配體2(CCL2)可將表達CCL2的炎性單核細胞招募至原發(fā)腫瘤和轉移部位，同時小鼠體內CCL2的中和作用則通過保留骨髓中單核細胞來抑制轉移。新近Bonapace L等卻報道了CCL2在4種乳腺癌轉移的同源基因小鼠模型中的矛盾現(xiàn)象。令人驚奇的是，終止CCL2抑制作用可導致腫瘤跨越性轉移，并加速動物死亡。這是由于骨髓中單核細胞釋放、原發(fā)腫瘤中癌細胞動員以及血管形成和在肺內轉移性細胞的一種IL- 6-及VEGF-A依賴形式增殖加快所致。

尤其顯著的是，CCL2和IL- 6的抑制作用顯著減輕癌細胞轉移并提高動物存活。迄今已知CCL2與多種不同腫瘤相關，作為治療標靶。然而，他們的研究結果認為，當考慮抗CCL2在腫瘤轉移疾病中作為一種單一療法時，需要謹慎而且強調了腫瘤微環(huán)境是成功抗癌細胞轉移的一個重要因素。

多數(shù)與乳腺癌相關的死亡是由重要器官中的轉移引起的。腫瘤微環(huán)境對癌細胞生長、散播和轉移是非常重要的。瘤內大量巨噬細胞與不良預后有關，而且乳腺癌中巨噬細胞浸潤與單核細胞化學誘導物CCL2的高表達相關。

而CCL2可以作為轉移乳腺癌的一個標靶，因為CCL2的高表達與乳腺癌患者生存率降低有關，同時由于表達CCL2受體的單核細胞通過小鼠體內血管內皮生長因子分泌而加速轉移。

他們肯定了CCL2中和作用對腫瘤生長轉移方面的作用。盡管抗CCL2治療對原發(fā)腫瘤生長沒有影響，但它減少了肺轉移和循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量。

活體內顯像實驗也證明，抗CCL2治療可降低瘤中癌細胞活動和血管滲漏。同時，我們發(fā)現(xiàn)血管附近更多的周細胞?？笴CL2血管滲漏的減少是與CTCS以及瘤內巨噬細胞數(shù)量減少有關。因此，CCL2中和作用減輕轉移不只受轉移前微環(huán)境的影響，而且也與減少癌細胞進入血管相關的。

接著，他們在治療結束后，測試了CCL2中和作用的抗轉移效果的持久性。治療10 d后，抗體被廓清，導致CCL2在肺中的反彈作用。驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)，停止抗CCL2治療會加速死亡。中斷抗CCL2治療10 d后， CCL2在肺和肝臟轉移中顯著增加而且CTC數(shù)量也有所增加。因此，雖然通過抗CCL2治療能減少轉移，當與對照組比較，終止治療則更加加快了轉移。然而，當繼續(xù)用抗CCL2抗體治療動物時，抗轉移影響仍可持續(xù)下去。

擇句翻譯：

Surprisingly, interruption of CCL2 inhibition leads to an overshoot of metastases and accelerates death. This is the result of monocyte release from the bone marrow and enhancement of cancer cell mobilization from the primary tumour, as well as blood vessel formation and increased proliferation of metastatic cells in the lungs in an interleukin (IL)- 6- and vascular endothelial growth factor (VEGF)-A-dependent manner.

令人驚奇的是，終止CCL2抑制作用可導致腫瘤跨越性轉移，并加速動物死亡。這是由于骨髓中單核細胞釋放及原發(fā)腫瘤中癌細胞動員，以及血管形成和在肺內轉移性細胞的一種IL- 6-及VEGF-A依賴形式增殖加快所致。

章靜波 審校

ox-LDL inhibits endothelial differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of rats

Lü Tie-wei1*, SUN Hui-chao1, LIU Ling-juan2, ZHANG Lei1, ZHENG Min1, ZHU Jing2, LIU Zhen-guo3, TIAN Jie1

(1.Dept. of Cardiology,Children’s Hospital of Chongqing Medical University; 2.Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Chongqing 400014， China; 3.the Ohio State University Medical Center, Heart and Lung Research Institution, Columbus Ohio 43210, USA)

Objective To investigate that ox-LDL inhibits endothelial differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in rats and its underlying mechanism. Methods Cultured MSCs were divided into four groups: blank groups, ox-LDL groups (5 μg/mL ox-LDL), ox-LDL+NAC groups (5 μg/mL ox-LDL and pre-treated NAC), and negative LDL groups (5 μg/mL nLDL). Cell morphology, endothelial marker and differentiation efficiency as well as signal of oxidative and pathway protein were detected after induction by Western blot, real-time PCR. Results MSCs can differentiate into endothelial cells with the expression of endothelial marker vWF,Flk- 1

and CD31 at the mRNA and protein level, vascular morphology, ox-LDL obvious inhibited endothelial differentiation of MSCs (P<0.05), but NAC can reverse the inhibition, the amount of ROS in ox-LDL groups was higher than that in ox-LDL+NAC groups(P<0.05), The expression of phosphorylated Akt decreased distinctly after treatment with ox-LDL(P<0.05), NAC can stimulated its expression close to normal. Conclusions ox-LDL can inhibit endothelial differentiation of MSCs via ROS, NAC in this procese shows inhibition to effect of ox-LDL and Akt signaling also played a critical role.

oxidized low density lipoprotein; bone marrow mesenchymal stem cells; endothlial cells; differentiation

2013- 11- 18

2014- 04- 18

重慶科委自然科學基金(2011BB5122:2011- 2014)

1001-6325(2015)01-0026-07

R364.1

A

??文 編譯自Nature， online 22 October 2014 .

10.1038/nature13862

*通信作者(corresponding author)：ltw200145@163.com