趙瑞

[摘要] 目的 探討高效液相色譜-熒光聯(lián)合測(cè)定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量方法的可行性。 方法 采用高效液相色譜-熒光聯(lián)合測(cè)定舒肝快胃丸中紫丁香苷的含量，Agilent 1200高效液相色譜儀Bond Elut C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm。 結(jié)果 線性關(guān)系考察中，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，g），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3800X-0.7300（r = 0.9998）。紫丁香苷在0.026～0.750 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。對(duì)3批藥材樣品中紫丁香苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果紫丁香苷的平均含量為1.113 mg/g，RSD為0.53%。 結(jié)論 本研究建立的高效液相色譜-熒光聯(lián)合檢測(cè)法靈敏度高，能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定舒肝快胃丸中紫丁香苷濃度，方法可行。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜-熒光；舒肝快胃丸；紫丁香苷；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）06（c）-0110-04

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人是一個(gè)整體，臟腑之間互為影響。肝若過(guò)熱，會(huì)影響胃液的分泌，即肝氣犯胃。以五行學(xué)說(shuō)解釋，肝屬木，脾屬土，而木克土，因此肝火過(guò)盛會(huì)令胃部同樣過(guò)熱不適。肝氣犯胃憂思惱怒、飲食不節(jié)暴飲暴食、脾胃虛弱病后脾胃受損等均可導(dǎo)致胃痛的發(fā)生。上述病因，既可單獨(dú)致病，又往往相互影響，而出現(xiàn)寒熱互見(jiàn)、虛實(shí)錯(cuò)雜、陰陽(yáng)并損之證候，臨證時(shí)必須靈活掌握。可見(jiàn)胃痛的關(guān)鍵是“氣”，所謂不通則痛。因此治療胃痛的關(guān)鍵是理順胃氣。舒肝快胃丸由厚樸（姜制）、陳皮、青皮、丁香、香附（醋制）、枳實(shí)、川芎、延胡索、姜黃、牡丹皮、白芍、砂仁、當(dāng)歸、吳茱萸等20味中藥制成的丸劑，氣香，味辛、微苦[1-5]。具有舒肝理氣、化滯消脹的效果，主要治療肝胃不和所致的兩肋脹痛，胃脘刺痛，惡心嘈雜嘔吐酸水[6-10]。目前《中國(guó)藥典》2010年版一部已給出了部分君藥及臣藥如厚樸中有效成分的要求，但關(guān)于丁香中主要成分紫丁香苷的測(cè)定報(bào)道較少。為進(jìn)一步控制藥品質(zhì)量，保證患者的用藥安全及效果，筆者參照國(guó)內(nèi)較多文獻(xiàn)擬建立一種靈敏、準(zhǔn)確、操作便捷的檢測(cè)方法，作為紫丁香苷質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)）、美國(guó)Supelco公司固相萃取儀（USA SUPELCO SPE），紫外檢測(cè)器，安捷倫Bond Elut C18固相萃取小柱（100 mg，1 mL），YOKO-XR薄層加熱器，CAMAG雙波長(zhǎng)紫外觀察箱，Camag Nanomat4點(diǎn)樣儀，HX-02B薄層顯色用的加熱板，真空干燥箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KQ5200DA超聲儀，水浴鍋，Sartorius BT125D電子天平。

1.2 材料

紫丁香苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：11574-201501，供含量測(cè)定用）；甲醇（色譜純）；水為超純水；其余試劑均為分析純；舒肝快胃丸（陜西辰濟(jì)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20155396，規(guī)格：200丸/瓶，批號(hào)：2015010101、2015010102、2015010103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Bond Elut C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm，Sigmar公司）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm。理論塔板數(shù)以紫丁香苷計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取紫丁香苷對(duì)照品5.00 mg，用流動(dòng)相定容于50 mL量瓶中，使成100 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于-4℃冰箱保存。

2.3 供試品儲(chǔ)備液的配制

取本品適量，研細(xì)，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲處理10 min（功率100 W，頻率50 kHz），放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方制備缺丁香的樣品，研細(xì)，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲處理10 min（功率100 W，頻率50 kHz），放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液制備成陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性樣品在紫丁香苷對(duì)照品出峰處未出現(xiàn)色譜峰，表明陰性樣品對(duì)紫丁香苷的測(cè)定無(wú)干擾。具體色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加10 mL/L鹽酸甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下分別吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，g），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3800X-0.7300（r = 0.9998）。結(jié)果提示，紫丁香苷在0.026～0.750 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液（濃度為0.090 mg/10 mL），連續(xù)進(jìn)樣5次，10 μL/次，測(cè)定紫丁香苷的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1，提示該方法有較高的精密度。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品5份（批號(hào)：2015010101），研細(xì)，精密稱取1.014 g，置20 mL量瓶中，加入甲醇超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過(guò)，測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表2，提示該方法重復(fù)性較強(qiáng)。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品6份（批號(hào)：2015010101）0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加入甲醇超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.5 μm）濾過(guò)，每個(gè)濃度共做2份，1份室溫放置，1份于-20℃下保存?zhèn)溆?。取室溫濃度質(zhì)控樣品分別于制備后0、2、4、6、8 h后進(jìn)行樣品分析，計(jì)算血藥濃度及RSD值，結(jié)果顯示，紫丁香苷RSD分別為2.03%、2.11%、1.24%，提示樣品溶液室溫放置8 h穩(wěn)定性良好；取-20℃下保存液樣品，解凍后再冷卻，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定5 d內(nèi)血液樣品的濃度及RSD值，結(jié)果顯示，紫丁香苷RSD分別為2.23%、2.20%、2.67%，提示樣品溶液在-20℃下放置5 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取樣品0.5 g，共9份，置25 mL容量瓶中，分別精密吸取1 mL濃度為0.5 mg/mL的紫丁香苷對(duì)照品溶液，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，測(cè)定紫丁香苷，計(jì)算加樣回收率。分別精密加入新鮮配制的0.5005 mg/mL紫丁香苷對(duì)照品溶液1.5、1.5、1.5、2.0、2.0、2.0、2.5、2.5、2.5 mL，加入甲醇適量，超聲（功率400 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.11 樣品含量測(cè)定

對(duì)3批藥材樣品（批號(hào)：2015010101、2015010102、2015010103）進(jìn)行紫丁香苷含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

凡由于脾胃受損、氣血不調(diào)所引起胃痛難耐胃脘部疼痛的病證，均可稱之為胃脘痛?！端貑?wèn)·六元正紀(jì)大論》曰：“民病胃脘當(dāng)心而痛?！薄夺t(yī)學(xué)正傳》說(shuō)：“古方九種心痛……詳其所由，皆在胃脘，而實(shí)不在于心”。導(dǎo)致胃痛原因常見(jiàn)的有寒邪客胃、肝氣犯胃、飲食傷胃、脾胃虛弱等。若寒邪客于胃中，寒凝不散，阻滯氣機(jī)，可致胃氣不和而疼痛；肝對(duì)脾胃有疏泄作用，惱怒抑郁，氣郁傷肝，肝失條達(dá)，橫逆犯胃，均可引發(fā)胃痛的發(fā)生，若勞倦內(nèi)傷，久病脾胃虛弱，或稟賦不足，中陽(yáng)虧虛，胃失溫養(yǎng)，內(nèi)寒滋生，中焦虛寒而痛；當(dāng)過(guò)食肥甘，食滯不化，氣機(jī)受阻或饑飽無(wú)度，飲食不節(jié)，胃失和降可導(dǎo)致胃痛；另氣郁日久，氣滯血瘀，瘀血內(nèi)結(jié)，中焦氣機(jī)受阻，而致胃痛發(fā)作。可見(jiàn)，胃痛發(fā)生的病機(jī)有虛實(shí)兩端之意，實(shí)證為氣機(jī)阻滯，不通則痛；虛證為胃腑失于溫煦或濡養(yǎng)，失養(yǎng)則痛。

臨床上舒肝快胃丸藥理作用主要有促進(jìn)胃排空，抑制胃酸分泌，加快腸道運(yùn)動(dòng)，緩解疼痛等，其是由香附（醋制）、丁香、白芍、佛手、木香、郁金、白術(shù)（炒）、陳皮、柴胡、廣藿香、炙甘草、萊菔子、檳榔（炒焦）、烏藥等研制而成的中藥制劑，輔料為蜂蜜。舒肝快胃丸可發(fā)揮各種中藥之功效，功能主治舒肝解郁、和胃止痛。常用于兩脅脹滿，食欲不振，呃逆嘔吐，胃脘疼痛，大便失調(diào)。其主要成分之一丁香中的紫丁香苷是一種強(qiáng)效抗肝毒藥物，其恢復(fù)微粒體酶系統(tǒng)的酶活性及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用可以促進(jìn)肝毒物代謝并改善肝功能使之正常化，并兼有止血功效。目前關(guān)于丁香中主要成分紫丁香苷的測(cè)定報(bào)道較少。為建立一種快速、靈敏的紫丁香苷的測(cè)定方法，本研究考察了諸多文獻(xiàn)報(bào)道[11-18]，選取C18柱固相萃取方法，比較甲醇、乙腈等多種溶劑對(duì)樣品雜質(zhì)的洗脫情況，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)一定比例的甲醇和緩沖液洗脫，既能有效除去雜質(zhì)[19-24]，又能保證紫丁香苷的高回收率，所得色譜圖分離完全，無(wú)測(cè)定干擾，不僅操作簡(jiǎn)便，而且重現(xiàn)性較好。

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究考察了不同濃度的甲醇-水-冰醋酸溶液，發(fā)現(xiàn)有機(jī)相的種類、濃度對(duì)舒肝快胃丸中紫丁香苷出峰時(shí)間的影響較大，且冰醋酸可消除色譜峰拖尾現(xiàn)象[25-29]。最后選定甲醇-水-冰醋酸（82∶18∶0.1）為流動(dòng)相，紫丁香苷的峰形較好，保留時(shí)間適宜，與其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，效果較為理想。

3.2 提取方法的選擇

采用超聲提取法，分別以不同提取時(shí)間（10、20、30 min）提取后，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，超聲處理10、20、30 min的提取結(jié)果差異不顯著，為保證提取效率，故采用超聲（功率100 W，頻率50 kHz）處理10 min為提取方法，分別以甲醇、水、10 mL/L鹽酸甲醇作為提取溶媒，超聲提取10 min后進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，以水為溶媒的提取結(jié)果略高于其他溶媒，但是用水作溶媒時(shí)，由于極性增大，雜峰較多，紫丁香苷的峰形較差[30-32]；而以甲醇作溶媒時(shí)基線較為平穩(wěn)，色譜峰對(duì)稱[11-12，29，31-33]，故選擇甲醇超聲提取10 min。

綜上所述，本文建立的高效液相色譜-熒光聯(lián)合檢測(cè)法靈敏度高，能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定舒肝快胃丸中紫丁香苷濃度，并通過(guò)陰性輔料干擾試驗(yàn)和一系列破壞性試驗(yàn)證明，該方法的專屬性強(qiáng)，耐用性好，且可控制舒肝快胃丸的質(zhì)量。

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（收稿日期：2015-03-25 本文編輯：李亞聰）