溫昱 李彬

[摘要] 目的 探討體外誘導(dǎo)小鼠骨髓CD45-細(xì)胞向竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞定向分化的方法。 方法 免疫磁珠分選小鼠骨髓CD45-細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，采用添加了5-氮胞苷和小鼠竇房結(jié)組織培養(yǎng)上清液的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)免疫熒光染色檢測(cè)起搏樣細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)絲蛋白-160（NF-160）和超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道（HCN）4表達(dá)，并采用qRT-PCR定量檢測(cè)起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達(dá)。 結(jié)果 小鼠骨髓CD45-細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到的分化細(xì)胞表達(dá)NF-160和HCN4；qRT-PCR分析顯示，與體外培養(yǎng)的小鼠竇房結(jié)細(xì)胞比較，分化起搏樣細(xì)胞NF-160和HCN4的表達(dá)升高，HCN2的表達(dá)降低。 結(jié)論 體外培養(yǎng)能夠?qū)⑿∈蠊撬鐲D45-細(xì)胞誘導(dǎo)分化為竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞，為構(gòu)建生物起搏器種子細(xì)胞提供選擇。

[關(guān)鍵詞] 起搏樣細(xì)胞；CD45；HCN4；NF-160；竇房結(jié)

[中圖分類號(hào)] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）06（b）-0009-04

Inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro

WEN Yu1 LI Bin2

1.Department of Histology & Embryology， Basic Medical College of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110122， China； 2.Department of Sports Medicine， Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110022， China

[Abstract] Objective To study method on inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro. Methods Mouse bone marrow CD45-cells were derived by using immunomagnetic beads system. After amplification in vitro， induced medium supplemented with 5-azacytidine and culture supernatant liquid of mouse sinoatrial node cells was used to cultivate. The expression on pacemaker-like cells markers of neurofilament protein （NF-160） and hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel （HCN） 4 were detected by immunofluorescence staining. The expression of pacing genes （NF-160， HCN4 and HCN2） were detected by qRT-PCR. Results Differentiated cells of bone marrow CD45-cells after induced by culture in vitro expressed NF-160 and HCN4. qRT-PCR analysis showed， compared with cultured sinoatrial node cells in vitro， the expression of NF-160 and HCN4 were higher， while expression of HCN2 was lower. Conclusion The sinoatrial node pacemaker-like cells can be induced and differentiated from mouse bone marrow CD45-cells， and the cells will be one choice of ideal seeding cells for biological pacemaker building.

[Key words] Pacemaker-like cells； CD45； HCN4； NF-160； Sinoatrial node

心律失常是常見(jiàn)病，嚴(yán)重將危及患者生命。目前，對(duì)于嚴(yán)重心律失常、病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者，安裝心臟起搏器是理想的治療方法[1-3]。隨著生物學(xué)及干細(xì)胞研究的發(fā)展，利用其相關(guān)技術(shù)逐步構(gòu)建生物起搏器，對(duì)受損心傳導(dǎo)系統(tǒng)的組織進(jìn)行修復(fù)或替代，尤其是竇房結(jié)功能重建，可以使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以修復(fù)[4-5]。構(gòu)建生物起搏器的種子細(xì)胞目前以干細(xì)胞為主[6-7]。由于骨髓源干細(xì)胞具有多向分化潛能，可自體獲得，并能夠在體外擴(kuò)增，是比較理想的種子細(xì)胞，所以本研究采用5-氮胞苷聯(lián)合竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓CD45-細(xì)胞，探討其分化為起搏樣細(xì)胞的可能性。研究周期為2014年8月～2015年1月，旨在為臨床因竇房結(jié)起搏細(xì)胞數(shù)量減少或功能衰退造成的心傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙、嚴(yán)重心律失常等疾病的替代治療以及生物起搏技術(shù)的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周齡，體重20～30 g，常規(guī)飼養(yǎng)，健康。

1.1.2 主要儀器和試劑 低糖DMEM和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone；DMEM-F12購(gòu)自Gibco；5-氮胞苷（5-azacytidine）購(gòu)自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠來(lái)源NF-160一抗和TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和DAPI購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit購(gòu)自Qiagen；PCR引物購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix購(gòu)自Invitrogen。免疫磁珠分選系統(tǒng)（Miltenyi Biotec），激光共聚焦顯微鏡（Nikon EZ-C1），PCR儀（Roche Light Cycler？誖480）。

1.2 小鼠骨髓CD45-細(xì)胞純化、擴(kuò)增

隨機(jī)取5只小鼠經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺(tái)無(wú)菌條件下取出小鼠股骨和脛骨數(shù)根，用低糖DMEM反復(fù)沖洗髓腔，收集沖洗液，經(jīng)400目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，1000 r/min離心6 min，棄上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重新混懸細(xì)胞，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)，1 d后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2天換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重新混懸，以1∶3傳代。培養(yǎng)大約1個(gè)月后，采用免疫磁珠分選系統(tǒng)，選取CD45抗體，按照說(shuō)明書(shū)操作，使細(xì)胞通過(guò)分選柱，收集CD45-細(xì)胞。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.3 小鼠竇房結(jié)組織分離、培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基上清液

余下5只小鼠經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺(tái)無(wú)菌條件下取出心臟，解剖顯微鏡下將心臟界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm大小組織塊，剪成1 mm左右大小的碎塊，添加0.07%胰蛋白酶消化，經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后，1000 r/min離心5 min，加入添加了20%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)4 h，吸出未貼壁細(xì)胞重置于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。每天半量換液。

1.4 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化骨髓CD45-細(xì)胞

收集竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，經(jīng)1000 r/min離心10 min，取上清與10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基1∶1混合，并添加10 mmol/L的5-氮胞苷，作為CD45-細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。CD45-細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后2～3周，選取生長(zhǎng)穩(wěn)定細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 免疫熒光檢測(cè)分化細(xì)胞起搏標(biāo)志物表達(dá)

將生長(zhǎng)良好的分化細(xì)胞接種至8孔Chamber中，培養(yǎng)過(guò)夜，常規(guī)免疫熒光染色，一抗兔HCN4（1∶200）、小鼠NF-160（1∶300），二抗TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶500），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠（1∶500）。激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化細(xì)胞起搏基因表達(dá)

選擇生長(zhǎng)良好的分化起搏樣細(xì)胞和小鼠竇房結(jié)細(xì)胞作為對(duì)照，采用RNA extraction kit提取兩種細(xì)胞的總RNA，稀釋濃度為200 ng/μL，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法檢測(cè)小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表達(dá)，選取GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表達(dá)結(jié)果以倍數(shù)變化表示。設(shè)立對(duì)照以確定無(wú)DNA污染。反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，Nuclease-free water 8.2 μL，NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4 μL，2X SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s），然后72℃再延伸10 min，4℃保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 SBYR Green法qRT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓CD45-細(xì)胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化細(xì)胞

CD45-細(xì)胞貼壁后多為短梭形、三角形、多邊形，排列無(wú)規(guī)律，細(xì)胞體積較小，分散生長(zhǎng)（圖1A）。生長(zhǎng)良好的CD45-細(xì)胞更換為條件培養(yǎng)基后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，體積變大，大小比較一致，多呈長(zhǎng)梭形，向同一方向生長(zhǎng)（圖1B）。

2.2 分化細(xì)胞起搏標(biāo)志物表達(dá)

經(jīng)免疫熒光染色后，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)分化細(xì)胞NF-160和起搏離子通道HCN4表達(dá)陽(yáng)性，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)呈絲狀表達(dá)的NF-160和HCN4，胞核未著色（圖2，見(jiàn)封三）。

2.3 誘導(dǎo)分化起搏樣細(xì)胞起搏基因qRT-PCR檢測(cè)

與培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞比較，分化起搏樣細(xì)胞NF-160、HCN4、HCN2基因表達(dá)水平不同，以倍數(shù)形式表示，其中NF-160、HCN4表達(dá)水平較培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞高（P < 0.01），而HCN2表達(dá)水平低于培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞（P < 0.01）。見(jiàn)表2和圖3。

表2 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達(dá)水平

注：與小鼠竇房結(jié)細(xì)胞比較，*P < 0.01

與小鼠竇房結(jié)細(xì)胞比較，*P < 0.01；誤差線表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)平均值

圖3 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達(dá)水平

3 討論

20世紀(jì)末，Makino等[8]首次以5-氮胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠體外分化為心肌樣細(xì)胞，部分細(xì)胞的動(dòng)作電位與心臟起搏細(xì)胞相似。隨后，大量研究圍繞起搏樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化展開(kāi)。目前，常用方法有應(yīng)用5-氮胞苷誘導(dǎo)分化方法[8-9]、起搏離子通道基因轉(zhuǎn)移方法[10-11]和竇房結(jié)細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)分化方法[12]。但是這些體外誘導(dǎo)分化條件仍不完善，單獨(dú)應(yīng)用成功率低，所以本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用5-氮胞苷和竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提高誘導(dǎo)效率。

5-氮胞苷誘導(dǎo)分化機(jī)制是可引起細(xì)胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，激活表達(dá)肌細(xì)胞的特異性啟動(dòng)或分化調(diào)控基因，從而使啟動(dòng)細(xì)胞向心肌分化，并表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，并有一部分細(xì)胞具有自律性[8，13]。由于竇房結(jié)是一個(gè)多態(tài)性的結(jié)構(gòu)，心臟成纖維細(xì)胞能通過(guò)縫隙連接提高心肌細(xì)胞間的交通，因而穩(wěn)定培養(yǎng)心肌的自發(fā)性收縮節(jié)律。因此，體外培養(yǎng)時(shí)不必將竇房結(jié)細(xì)胞完全分離純化。竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)CD45-細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用依賴于竇房結(jié)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以為干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞分化提供一個(gè)接近于竇房結(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。

研究表明，竇房結(jié)起搏細(xì)胞的電生理特性為舒張期自動(dòng)除極化，起主要作用的是起搏電流，其分子基礎(chǔ)是HCN，包括HCN1～HCN4，小鼠心臟主要表達(dá)HCN4和HCN2，以竇房結(jié)細(xì)胞HCN表達(dá)水平最高，所以選擇HCN4和HCN2作為檢測(cè)指標(biāo)[14-17]。

本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓細(xì)胞直接接種，然后經(jīng)免疫磁珠分選其中的CD45-細(xì)胞，換用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的方法，從成年小鼠骨髓源干細(xì)胞得到竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)便，得到細(xì)胞量大，細(xì)胞成活率高，傳代后，細(xì)胞形態(tài)漸趨同一，排列趨同一個(gè)方向，光鏡下可見(jiàn)胞體呈梭形，胞質(zhì)淡染，胞核明顯，位于胞體中央。筆者采用小鼠竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，并添加5-氮胞苷作為條件培養(yǎng)基，得到的起搏樣細(xì)胞能夠表達(dá)起搏離子通道HCN4和神經(jīng)絲蛋白NF-160，由qRT-PCR結(jié)果看出，分化細(xì)胞表達(dá)起搏離子通道，符合起搏細(xì)胞特點(diǎn)，說(shuō)明得到的細(xì)胞大部分是起搏樣細(xì)胞。形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)染色研究顯示，得到的細(xì)胞具有較好的生物學(xué)活性，證明誘導(dǎo)分化方法有效，得到起搏樣細(xì)胞在體外能夠存活較長(zhǎng)時(shí)間，并保持其生物學(xué)活性，為生物起搏器奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前仍有尚未解決的問(wèn)題，比如得到的細(xì)胞并非全部是起搏樣細(xì)胞，還包含有其他細(xì)胞成分，這些混雜的細(xì)胞會(huì)對(duì)進(jìn)一步研究帶來(lái)干擾，因此進(jìn)一步完善誘導(dǎo)分化條件或增加分化后的篩選指標(biāo)，利用流式細(xì)胞分離技術(shù)或免疫磁珠分選，對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行分離提純，以提高細(xì)胞純度。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Gittenberger-de Groot AC，Calkoen EE，Poelmann RE，et al. Morphogenesis and molecular considerations on congenital cardiac septal defects [J]. Ann Med，2014，46（8）：640-652.

[2] Sah R，Mesirca P，Mason X，et al. Timing of myocardial trpm7 deletion during cardiogenesis variably disrupts adult ventricular function，conduction，and repolarization [J]. Circulation，2013，128（2）：101-114.

[3] 馬立軍，張勤.急診心律失常中應(yīng)用體外無(wú)創(chuàng)性心臟起搏的作用綜合評(píng)價(jià)[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52（9）：31-33.

[4] Aanhaanen WT，Mommersteeg MT，Norden J，et al. Developmental origin，growth，and three-dimensional architecture of the atrioventricular conduction axis of the mouse heart [J]. Circ Res，2010，107（6）：728-736.

[5] Hashem SI，Claycomb WC. Genetic isolation of stem cell-derived pacemaker-nodal cardiac myocytes [J]. Mol Cell Biochem，2013，383（1-2）：161-171.

[6] Ye SX，Qu Y，Dan P，et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart [J]. Circ Arrhythm Electrophysiol，2011，4（6）：936-946.

[7] Vincent SD，Buckingham ME. How to make a heart：the origin and regulation of cardiac progenitor cells [J]. Curr Top Dev Biol，2010，90：1-41.

[8] Makino S，F(xiàn)ukuda K，Miyoshi S，et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro [J]. J Clin Invest，1999，103（5）：697-705.

[9] Pauza DH，Saburkina I，Rysevaite K，et al. Neuroanatomy of the murine cardiac conduction system：a combined stereomicroscopic and fluorescence immunohistochemical study [J]. Auton Neurosci，2013，176（1-2）：32-47.

[10] Ou Y，Niu XL，Ren FX. Expression of key ion channels in the rat cardiac conduction system by laser capture microdissection and quantitative real-time PCR [J]. Exp Physiol，2010，95（9）：938-945.

[11] Greener ID，Monfredi O，Inada S，et al. Molecular architecture of the human specialised atrioventricular conduction axis [J]. J Mol Cell Cardiol，2011，50（4）：642-651.

[12] Pauza DH，Rysevaite K，Inokaitis H，et al. Innervation of sinoatrial nodal cardiomyocytes in mouse. a combined approach using immunofluorescent andelectron microscopy [J]. J Mol Cell Cardiol，2014，75：188-197.

[13] Moretti A，Caron L，Nakano A，et al. Multipotent embryonic isl1+ progenitor cells lead to cardiac，smooth muscle，and endothelial cell diversification [J]. Cell，2006， 127（6）：1151-1165.

[14] Sp？覿ter D，Abramczuk MK，Buac K，et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells [J]. Nat Cell Biol，2013， 15（9）：1098-1106.

[15] Yamamoto M，Dobrzynski H，Tellez J，et al. Extended atrial conduction system characterized by the expression of the HCN4 channel and connexin45 [J]. Cardiovasc Res，2006，72（2）：271-281.

[16] Garcia-Frigola C，Shi Y，Evans SM. Expression of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel HCN4 during mouse heartdevelopment [J]. Gene Expr Patterns，2003，3（6）：777-783.

[17] Herrmann S，Layh B，Ludwig A. Novel insights into the distribution of cardiac HCN channels：an expression study in the mouse heart [J]. J Mol Cell Cardiol，2011，51（6）：997-1006.

（收稿日期：2015-03-15 本文編輯：李亞聰）