張璐瑩，羅春海，許啟有，李詩瑩，鄒曉，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

子宮內(nèi)膜炎是奶牛主要疾病之一，對畜牧經(jīng)濟有著直接的經(jīng)濟影響。子宮內(nèi)膜炎主要發(fā)生的原因為細菌感染[1]，而目前臨床治療仍舊以抗生素為主要治療方法，伴隨著耐藥性和藥物殘留問題的日益凸顯，臨床治療上需要可以替代抗生素的新型藥物[2]。溶菌酶作為一種綠色藥物[3]，受到了人們的關(guān)注，其具有殺菌效果強、菌譜廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[4-5]。以此為基礎(chǔ)，實驗室通過畢赤酵母表達系統(tǒng)制備了重組牛乳溶菌酶，并對其純化濃縮后獲得重組牛乳溶菌酶粉劑，不僅具有以上的生物學作用，同時具有同源性的優(yōu)勢。實驗主要通過對牛乳溶菌酶進行溶血試驗和刺激性試驗，進行安全性評價，為進一步臨床試驗提供保障和依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

健康白兔家兔6 只，體重2.0～2.5 kg。

1.2 溶菌酶

實驗室制備的重組牛乳溶菌酶粉劑。

1.3 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學診斷實驗室提供。

2 方法

2.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的確定

2.1.1 牛乳溶菌酶溶液和菌液的制備

取實驗室已獲得的純化濃縮后的重組牛乳溶菌酶粉劑，用蒸餾水配制成濃度為10.0 mg·mL-1的牛乳溶菌酶溶液[6]。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，挑取少量單個菌落加入肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h，分別制成肉湯培養(yǎng)基。

2.1.2 牛乳溶菌酶抑菌效果的測定

取15 只試管于試管架上，分別加入已制成的含菌肉湯培養(yǎng)基1 mL。在1 號試管中加入1 mL 牛乳溶菌酶溶液，之后倍比稀釋，最后一支試管不加。再分別加入100 μL 金黃色葡萄球菌菌液，混勻。大腸桿菌、無乳鏈球菌同樣操作，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

2.2 牛乳溶菌酶溶血性試驗

2.2.1 2%兔紅細胞混懸液的配制

健康家兔心臟取血20 mL，于帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩搖晃10 min。將除去纖維蛋白原的血液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入10 mL 生理鹽水，混勻，2 500 r·min-1離心5 min。棄上清后加入生理鹽水，混勻后繼續(xù)離心。重復步驟，用生理鹽水洗滌3 次，至上清不為紅色為止。取管底2 mL 紅細胞液，與98 mL 生理鹽水配制成2%的兔紅細胞混懸液。

2.2.2 溶血試驗

在試管架上排列7 支試管并標號，將牛乳溶菌酶溶液、生理鹽水、2%兔紅細胞混懸液和蒸餾水按表1 加入試管中。其中，6 號試管不加牛乳溶菌酶溶液作為空白對照，7 號試管只加2%兔紅細胞混懸液和蒸餾水作為陽性對照。將1～6 號試管置于37 ℃恒溫箱中，分別在1 h、2 h、3 h 時觀察并記錄溶液變化情況[7]。

表1 溶血試驗各溶液加樣值Table 1 Sample solution of Hemolysis test

2.3 牛乳溶菌酶刺激性試驗

選取正常健康白色家兔6 只，排除眼角膜、虹膜和結(jié)膜有病變和炎癥變化的，試驗進行自身對照。試驗時在右眼滴加0.1 mL 生理鹽水，左眼滴加0.1 mL的牛乳溶菌酶溶液，然后使兔子閉合眼睛10 s 左右。在滴眼后2、6、12、24、48、72 h 對家兔左右眼進行檢查，根據(jù)表2 進行眼刺激反應(yīng)評分[8]，并按照表3 進行眼刺激強度評價。

表2 眼刺激反應(yīng)評分標準Table 2 Score standard of eye irritative action

表2 眼刺激反應(yīng)評分標準Continued table 2 Score standard of eye irritative action

表3 眼刺激評價標準Table 3 Level standard of eye irritative action

3 結(jié)果

3.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的確定結(jié)果

抑菌試驗結(jié)果，牛乳溶菌酶對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，大腸桿菌、無乳鏈球菌的抑菌效果相對較弱。金黃色葡萄球菌從13 號試管開始出現(xiàn)渾濁，表明其中有細菌生長，大腸桿菌和無乳鏈球菌分別從3 號和6 號開始出現(xiàn)細菌生長現(xiàn)象，具體抑菌結(jié)果見表4。

表4 牛乳溶菌酶抑菌試驗結(jié)果Table 4 Results of LYZ-1 bacteriostatic test

3.2 牛乳溶菌酶溶血性試驗結(jié)果

在3 個時間點中除7 號試管的陽性對照溶液呈澄明紅色外，其余6 支試管內(nèi)溶液均未呈澄明紅色，上層液體為無色透明，紅細胞全部下沉，振蕩搖晃試管可見紅細胞在溶液中均勻分散。溶血試驗結(jié)果表明，牛乳溶菌酶溶液無溶血和凝集作用。試驗結(jié)果見表5。

表5 溶血性試驗結(jié)果Table 5 Results of hemolysis

3.3 牛乳溶菌酶刺激性試驗結(jié)果

家兔左眼用藥后，在6 h 后有輕度的眼角膜充血現(xiàn)象，12 h 出現(xiàn)少量分泌物，無水腫現(xiàn)象，隨著時間的延后，刺激性逐漸減弱，24 h 后充血現(xiàn)象消失，但分泌物依然存在，48 h 后基本表現(xiàn)正常（見表6）。根據(jù)評分結(jié)果，牛乳溶菌酶對黏膜無刺激。

表6 牛乳溶菌酶刺激性試驗結(jié)果Table 6 Results of eye irritetive action

4 討論

牛乳溶菌酶作為一種新型的生物制劑，應(yīng)用于臨床治療，不僅能夠抑制細菌的生長，還能增強牛自身的免疫力[9]，并且可以促進子宮內(nèi)膜的恢復[10]。奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌[11]，牛乳溶菌酶對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌效果，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有一定抑菌效果。根據(jù)藥典2010 版，試驗進行了動物安全性試驗，為牛乳溶菌酶應(yīng)用于臨床提供保障。易明梅等討論驗證了溶菌酶基因藥物應(yīng)用于奶牛后，對乳汁、尿液以及其他分泌物、排泄物等進行檢測，結(jié)果顯示溶菌酶基因藥物對環(huán)境同樣是安全的。因此，初步完成了牛乳溶菌酶應(yīng)用于臨床前的安全性試驗，其臨床效果還有待臨床試驗時進一步探索和驗證。

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