興述懷 朱春曉 張 瑞 趙 越 任亞浩 安 麗
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110001)
阿爾茨海默病(AD)不僅可以影響患者及其照顧者的生活質(zhì)量,而且增加了醫(yī)療成本,給全球帶來(lái)了重大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。85歲以上的老年人群中AD的患病率更是高達(dá)20%以上〔1〕。目前我國(guó)AD患者已超過(guò)600萬(wàn),65歲以上人群當(dāng)中患病率平均為6.6%,而且患病率每5年約增長(zhǎng)1倍,80歲以上已超過(guò)22%。萊菔硫烷(SFN)是一種主要存在于十字花科類植物中的異硫氰酸酯類物質(zhì),具有抗癌、抗凋亡、抗氧化以及清除自由基等生物功能〔2〕,研究發(fā)現(xiàn)SFN有很好的神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕,然而關(guān)于SFN對(duì)AD的干預(yù)研究目前未見報(bào)道。AD早期表現(xiàn)主要以輕度認(rèn)知記憶能力損傷為主,而海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分是近期記憶回路的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),是認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)和神經(jīng)中樞〔4〕,海馬的CA1區(qū)與認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)且最易發(fā)生老化〔5〕。本研究采用鋁與D半乳糖聯(lián)合染毒建立AD小鼠模型〔6〕,通過(guò)觀察小鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變,海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,探討SFN對(duì)AD模型小鼠的干預(yù)作用。
1.1 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)處理 健康成年C57BL/6小鼠(18~22 g)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將小鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組,每組10只,雌雄各半。模型組與干預(yù)組小鼠連續(xù)13 w喂飼含鋁水(鋁濃度0.4 g/100 ml),并隔日1次皮下注射200 mg/kg D-半乳糖;參照文獻(xiàn)〔7〕,干預(yù)組小鼠每日一次灌胃給予25 mg/kg SFN,模型組小鼠灌胃等量蒸餾水;對(duì)照組喂飼蒸餾水,并以相同的處理方式給予等量溶媒。
1.2 主要試劑與儀器 D-半乳糖與三氯化鋁(Sigma公司)、SFN(Toronto Research Chemicals,加拿大);Morris水迷宮、木質(zhì)曠場(chǎng)(自制)、攝影顯微鏡(Olympus,日本)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2155,德國(guó))、透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650,日本)
1.3 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)
1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)〔8〕采用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。Morris水迷宮是由一直徑為100 cm、高為50 cm的圓形水池組成。將水池分成4個(gè)象限,將直徑15 cm的圓形平臺(tái)固定放置于第2象限中央處,圓臺(tái)浸沒于水下1 cm,水溫為(22±2)℃。迷宮正上方裝有攝像頭,小鼠行程可被記錄下來(lái)。測(cè)試包括:①定位航行實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)每天相同時(shí)間進(jìn)行,連續(xù)4 d,1次/d,分別從4個(gè)象限邊緣1/2弧度處將小鼠頭朝池壁入水,小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期,自動(dòng)攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄每只小鼠需找到平臺(tái)的逃避潛伏期,若小鼠入水后60 s內(nèi)未能找到平臺(tái),則將其引置于平臺(tái)上并停留10 s,引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶,此時(shí)逃避潛伏期記錄為60 s。②空間探索實(shí)驗(yàn):在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2天撤去圓臺(tái),于第四象限1/2弧度處入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中,電腦記錄60 s內(nèi)小鼠跨越圓臺(tái)所在位置的次數(shù)。
1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)〔9〕應(yīng)用自制木質(zhì)曠場(chǎng)觀察小鼠適應(yīng)新環(huán)境的空間認(rèn)知與自主探索能力。實(shí)驗(yàn)裝置為一木制曠場(chǎng)(100 cm×100 cm×30 cm),將箱底劃分成25個(gè)20 cm×20 cm方格,四壁為外周格,中央為中央格。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),將小鼠放在中央格處,觀察錄像中3 min內(nèi)小鼠在中央格停留時(shí)間、跨格個(gè)數(shù)、直立次數(shù)。
1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)
1.4.1 尼氏染色 每組各取8只小鼠,乙醚麻醉處死后迅速取腦,制成5 μm石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精脫蠟,水洗,37℃溫箱內(nèi)硫堇浸染30 min,水洗,95%酒精分化20 s,水洗,梯度酒精與二甲苯脫水,最后使用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化,隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù),結(jié)果以所觀察視野的平均細(xì)胞數(shù)表示。
1.4.2 電鏡標(biāo)本制作 每組另外2只小鼠處死后迅速剝離海馬組織,并將1.5 mm3海馬CA1區(qū)移置于0.38 mol/L戊二醛PBS溶液中固定1 h,0.039 mol/L四氧化鋨中固定2 h,然后經(jīng)酒精及丙酮系列脫水,使用環(huán)氧樹脂包埋制成超薄切片,切片使用醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色。透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。
2.1 神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果 隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加,各組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短,說(shuō)明各組小鼠均有一定的記憶能力;實(shí)驗(yàn)開始第1天模型組小鼠逃避潛伏期與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05);干預(yù)組小鼠與模型組相比,逃避潛伏期有所縮短。從第2天起,模型組小鼠逃避潛伏期與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05)干預(yù)組小鼠與模型組相比,逃避潛伏期縮短(P<0.05)??臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示:模型組穿越原圓臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05);干預(yù)組小鼠與模型組相比,穿越原圓臺(tái)所在位置的次數(shù)增多(P<0.05)。見表1。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):模型組小鼠與對(duì)照組相比,穿越跨格數(shù)減少,中央格停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05),直立次數(shù)減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而干預(yù)組小鼠與模型組相比,穿越跨格次數(shù)明顯增加(P<0.05),中央格停留時(shí)間有減少的趨勢(shì),直立次數(shù)有所增加,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表1 水迷宮定位航行與空間探索結(jié)果(n=10,±s)
表1 水迷宮定位航行與空間探索結(jié)果(n=10,±s)
與對(duì)照組相比較:1)P<0.05,與模型組相比較:2)P<0.05,下表同
組別 第1天 第2天 第3天 第4天 穿越平臺(tái)(次)對(duì)照組24.40±11.43 19.22±4.41 14.82±6.59 7.45±3.23 2.90±1.85模型組35.02±10.831)29.67±6.591)23.40±8.311)15.72±7.491)1.00±0.941)干預(yù)組 28.70±8.19 21.52±6.862)16.42±7.452)8.62±3.262)3.10±2.232)
表2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)
表2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)
直立次數(shù)對(duì)照組組別 跨格數(shù) 中央格停留時(shí)間(s)42.40±18.95 2.70±1.63 6.80±4.46模型組 27.60±10.521) 8.60±9.131) 4.00±3.46干預(yù)組 44.90±13.172)3.60±4.37 5.10±4.45
2.2 電鏡觀察結(jié)果 對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核膜光滑,線粒體結(jié)構(gòu)正常,形態(tài)呈圓形或橢圓形,突觸結(jié)構(gòu)清晰完整。模型組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所損傷,細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則,線粒體出現(xiàn)空泡狀異常,突觸結(jié)構(gòu)受損,突觸間隙模糊。干預(yù)組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整,細(xì)胞核形態(tài)較為正常,線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,突觸結(jié)構(gòu)較為完整,突觸間隙基本正常。見圖1。
2.3 尼氏染色結(jié)果 如圖2所示,對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多,排列緊密,結(jié)構(gòu)完整;模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列散亂不規(guī)則。干預(yù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較為正常,細(xì)胞排列較為規(guī)則。見圖1。模型組小鼠(55.81±9.57)海馬CA1區(qū)平均每個(gè)視野的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組小鼠(72.76±8.04)(P<0.05),與模型組小鼠(55.81±9.57)相比,干預(yù)組小鼠(68.73±8.74)海馬CA1區(qū)平均每個(gè)視野的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)。
圖1 小鼠海馬CA1區(qū)電鏡結(jié)果(×20 000)
圖2 小鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果(×200)
AD主要引起病患認(rèn)知功能的損傷,在臨床上通常表現(xiàn)為神經(jīng)行為學(xué)的變化。目前已有許多藥物可以改善AD病患的認(rèn)知功能,但長(zhǎng)期使用的毒副作用不容忽視。隨著姜黃素、白藜蘆醇、茶多酚等植物化學(xué)物對(duì)AD的防治作用逐漸被人們所證實(shí),利用天然的膳食成分防治AD的研究日益受到關(guān)注。SFN廣泛存在于西蘭花等十字花科植物中,是一種天然的、有效性較強(qiáng)的、間接的抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)〔3,10〕,SFN在慢性缺血性腦損傷和急性給予6-羥基多巴胺腦染毒動(dòng)物模型中都已被證實(shí)具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。另有學(xué)者報(bào)道〔11〕,SFN對(duì)PD的神經(jīng)行為損傷亦有一定的改善作用,還有實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用SFN作用于皮質(zhì)損傷后的大鼠可以顯著提高其空間學(xué)習(xí)和記憶能力,并可緩解認(rèn)知功能障礙〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)SFN可明顯改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能,說(shuō)明了SFN對(duì)認(rèn)知功能障礙具有正向干預(yù)作用。
SFN對(duì)AD小鼠產(chǎn)生的干預(yù)作用可能與多種機(jī)制有關(guān)。研究證明〔13〕,經(jīng)SFN預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬中Nrf2和血紅素氧合酶-1表達(dá)增強(qiáng),從而可以減弱神經(jīng)細(xì)胞損傷及抑制炎癥反應(yīng)的現(xiàn)象。SFN還能夠通過(guò)激活Nrf2-ARE通路,從而誘導(dǎo)一系列Ⅱ相酶和抗氧化酶進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力〔12〕,而這種抗氧化作用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中干預(yù)組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較模型組顯著增加;超微層面觀察小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)干預(yù)組小鼠與模型組相比核膜與細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)損傷也都有所修復(fù),可見SFN對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷具有一定的修復(fù)作用。SFN亦能上調(diào)醌氧化還原酶-1等的表達(dá)抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的未成熟海馬神經(jīng)元的死亡〔14〕,此機(jī)制可能與本實(shí)驗(yàn)中干預(yù)組海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)有關(guān)。SFN還具有防止細(xì)胞膜損傷,抑制DNA片段分解和阻抑活性氧形成等的生物功效〔15〕,線粒體的異常改變與活性氧具有一定聯(lián)系,SFN可能通過(guò)修復(fù)線粒體進(jìn)而增強(qiáng)海馬內(nèi)的能量代謝,提升神經(jīng)細(xì)胞活力達(dá)到改善認(rèn)知功能的目的。此外,本實(shí)驗(yàn)采用的是鋁聯(lián)合D半乳糖染毒造模,而SFN可以拮抗一些有害金屬元素〔16〕,增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)有害元素毒性的抵抗力以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活。
總之,SFN可明顯改善AD模型小鼠認(rèn)知功能,保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞,但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
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