錢 程 施 丹 武 寧 程光惠(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 30033)

盡管放射治療在腫瘤的治療過程中起到了至關(guān)重要的作用，但放射治療過程中不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織細(xì)胞也有殺傷作用，并伴隨著產(chǎn)生了神經(jīng)毒性、腎毒性、骨髓抑制、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)〔1〕。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等植物的根莖中提取出來的多元酚，具有多種藥理活性:抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗氧化、抗凝、抗微生物等〔2～4〕，尤其具有明確的抗腫瘤作用〔5〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素對(duì)宮頸癌、肝癌、喉癌等具有放療增敏作用〔6～8〕，但對(duì)放療致機(jī)體損傷的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬觀察姜黃素對(duì)放療致Lewis肺癌荷瘤小鼠機(jī)體損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 C57BL/6純系小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～22 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)7 d，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK11-00-0006。

1.2 試劑與材料 姜黃素購(gòu)自Sigma公司，－20℃保存，使用前用0.5%CMC-Na溶液稀釋至所需濃度;Lewis肺癌瘤株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;Yac-1細(xì)胞、CTLL2依賴細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白(Con)A購(gòu)自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;新生小牛血清(FCS)購(gòu)自杭州四季青生物有限公司;DMSO購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品責(zé)任有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 取傳代Lewis肺癌生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，研磨成腫瘤勻漿，PBS洗2遍，以RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的濃度(1×106±5%)個(gè)/0.2 ml。接種于C57BL/6小鼠左腹股溝皮下，0.2 ml/只。接種成功以移植瘤長(zhǎng)至直徑5 mm為標(biāo)準(zhǔn)，按體重將荷瘤小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、放射組、姜黃素組和姜黃素+放射聯(lián)合組。

1.4 姜黃素對(duì)荷瘤小鼠放療后瘤重及抑瘤率的影響 待腫瘤體積為100 mm3時(shí)，對(duì)照組和放射組給予等體積0.5%CMC-Na灌胃，姜黃素組灌胃給予姜黃素15 mg/kg，放射組一次性給予20 Gy射線照射，聯(lián)合組給予姜黃素15 mg/kg和一次性20 Gy射線照射。照射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，末次給藥后處死小鼠，稱取體重、腫瘤重量及體積，脾及胸腺重量，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率(IR)。IR(%)=(模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5 姜黃素對(duì)荷瘤小鼠放療后外周血白細(xì)胞及骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 給藥后各組隨機(jī)取10只動(dòng)物(雌雄各半)，腹主動(dòng)脈采血50 μl注入稀釋液中，用全自動(dòng)動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血常規(guī)計(jì)數(shù)。然后剝離左側(cè)股骨，以3%醋酸10 ml沖出骨髓細(xì)胞，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，計(jì)算1根骨內(nèi)的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量。

1.6 姜黃素對(duì)荷瘤小鼠放療后T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響無菌取脾制成單細(xì)胞懸液，洗2遍，用含10%FCS的培養(yǎng)基調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每只鼠3復(fù)孔。對(duì)照孔每孔加100 μl RPMI1640培養(yǎng)液，ConA 刺激孔每孔加 100 μl ConA(終濃度為 5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，加入 MTT 溶液(5 mg/ml)每孔 10 μl，繼續(xù)孵育4 h。吸棄孔內(nèi)上清液，加入 DMSO 100 μl，振蕩10 min。于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。SI=ConA刺激孔OD均值/對(duì)照孔OD均值。

1.7 姜黃素對(duì)荷瘤小鼠放療后NK細(xì)胞活性的影響 取濃度為1×107個(gè)/ml脾單細(xì)胞懸液，調(diào) AC-1細(xì)胞懸液(活性 ＞95%)濃度至5×106個(gè)/ml。取96孔培養(yǎng)板，每只鼠設(shè)效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞(20∶1)孔，加100 μl脾細(xì)胞懸液，100 μl YAC-1 細(xì)胞懸液;效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔:100 μl脾細(xì)胞懸液+100 μl RPMI1640培養(yǎng)液;靶細(xì)胞對(duì)照孔:100 μl YAC-1懸液+100 μl RPMI1640培養(yǎng)液，均設(shè)3復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，各孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值。計(jì)算NK細(xì)胞毒百分率(%)=〔靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值－(效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值－效應(yīng)細(xì)胞OD值)〕/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0用軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間差異比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)放射治療小鼠Lewis肺癌的增敏作用 與對(duì)照組比較，放射組荷瘤小鼠體重、瘤重及腫瘤體積明顯降低(P＜0.01或P＜0.001);姜黃素亦可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.01)，腫瘤抑制率為33.78%。聯(lián)合應(yīng)用姜黃素和放射治療可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.001)，腫瘤抑制率為65.25%。與單獨(dú)放射治療比較，聯(lián)合應(yīng)用可對(duì)抗放療致荷瘤小鼠體重降低(P＜0.01)，且荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯下降(P＜0.01)，腫瘤抑制率顯著升高(P＜0.001)。見表1。

2.2 姜黃素對(duì)放射治療小鼠Lewis肺癌的減毒作用 與對(duì)照組比較，放射組在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)臟器指數(shù)、外周血白細(xì)胞總數(shù)及骨髓有核細(xì)胞數(shù)均明顯下降(P＜0.01或P＜0.001)。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數(shù)、外周血白細(xì)胞總數(shù)及骨髓有核細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數(shù)、外周血白細(xì)胞總數(shù)及骨髓有核細(xì)胞數(shù)比較(±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與放射組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.001

組別 n 體重(g) 瘤重(g) 腫瘤體積(mm3) 胸腺指數(shù) 脾指數(shù) 白細(xì)胞(×109/L)骨髓有核細(xì)胞(×106/L)16±0.031 0.423±0.103 11.21±2.39 13.25±4.21放射組 13/11 19.18±2.891) 0.69±0.131)1 896.5±222.31)0.08±0.0232) 0.412±0.085 5.05±2.172) 4.04±1.232)姜黃素組 10/10 20.50±1.79 0.65±0.171)1 716.4±211.61)0.09±0.0212)0.392±0.0811)3)6.96±1.271)3)6.33±2.091)3)姜黃素+放射聯(lián)合組 10/10 20.98±2.633)0.37±0.122)3)1 024.9±188.92)3)0.18±0.0273)0.358±0.0661)3)8.87±2.351)4)8.25±1.341)4)對(duì)照組 12/12 21.78±2.53 1.09±0.21 2 140.6±289.64 0.

2.3 姜黃素對(duì)放射治療小鼠Lewis肺癌T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和NK細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，放射組ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)〔(0.15±0.04)vs(0.22±0.05)〕及小鼠NK細(xì)胞活性明顯降低〔(15.17±3.78)%vs(20.15±3.79)%，P＜0.05〕。姜黃素與放射治療合用，可使ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著升高〔0.31±0.06，P＜0.05〕，亦可明顯提高小鼠NK細(xì)胞活性〔(22.16±2.79)%，P＜0.05〕。姜黃素組SI為0.23±0.06，NK細(xì)胞活性為(20.02±3.17)%。

3 討論

應(yīng)用有效的輔助藥物減輕放療所致的機(jī)體損傷已成為腫瘤治療中不可或缺的一部分。在腫瘤末期，患者的免疫缺陷顯得尤為明顯〔9〕。因此，對(duì)腫瘤患者來說，提高自身的免疫力是極為重要的。生理狀態(tài)下，肺臟含有相對(duì)數(shù)量多的NK細(xì)胞，是重要的、潛在的抗腫瘤效應(yīng)器〔10〕，在治療肺癌的過程中，研究NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高荷瘤小鼠的腫瘤抑制率，縮小腫瘤的體積，與放療協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用;姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用可減輕單獨(dú)放療所致的骨髓抑制、外周血白細(xì)胞水平降低、免疫器官萎縮，對(duì)放療有減毒增效的作用;姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用放療對(duì)NK細(xì)胞活性及T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能作用明顯，可使NK細(xì)胞活性及T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能均顯著提高，提示姜黃素能增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫力。綜上所述，姜黃素對(duì)放療致荷瘤小鼠機(jī)體損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗貧血、升高白細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

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