張貴萍 周愛玲 張國霞 胡亞娥 茅家慧 (南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，江蘇 南通 226001)

神經(jīng)退行性疾病(ND)的病因和發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，迄今不十分明確。但它們都有一個共同的特征，即發(fā)生神經(jīng)元的退行性病變和凋亡，并最終導(dǎo)致個體死亡。目前對ND的機(jī)制及治療已進(jìn)行了大量的研究，但至今對其發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不甚清晰，且尚無有效成熟的方法和藥物來防治這種疾病。Toll樣受體4(TLR4)為代表的TLRs被認(rèn)為參與了阿爾茨海默病(AD)的炎性反應(yīng)，并在其起病進(jìn)展和病理生理過程中擔(dān)負(fù)了重要的責(zé)任〔1〕。TLR4與其外源性或內(nèi)源性配體結(jié)合，激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路大致可以分為髓樣細(xì)胞分化因子88(MyD88)依賴型途徑〔2〕和MyD88非依賴型途徑引起炎癥介質(zhì)釋放。研究發(fā)現(xiàn)，TLR相關(guān)分子(TRAM)和TLR相關(guān)的干擾素活化子(TRIF)為TLR4信號所特有，僅參與TLR4的MyD88非依賴型途徑〔3〕，因此，TRAM、TRIF及相應(yīng)炎癥因子的水平增高可反映MyD88非依賴型途徑的激活。本實(shí)驗(yàn)擬在細(xì)胞和分子水平探討海馬神經(jīng)元TLR4的MyD88非依賴途徑在神經(jīng)炎癥中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新生1 d的SPF級SD大鼠，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號:SYXK(蘇)2007-0021。

1.2 主要藥品與儀器 DMEM/F12購自Gibco公司，LPS購自Sigma公司，PCR引物由上海睿安生物科技有限公司合成，轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamineTMRNAiMA購自 Invitrogen公司，MyD88 siRNA Oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，兔抗大鼠TRIF多克隆抗體購自Abcam公司，ELISA試劑盒〔TRAM、干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP)-10、白細(xì)胞介素(IL)-1β〕購自RB公司。日本OLYMPUS的倒置熒光相差顯微鏡(IX51)，Applied Biosystems StepOne的實(shí)時定量PCR儀，美國Bio-Rad公司的Mini protein-3電泳裝置，日本SANYO的－80℃超低溫冰箱和MLS-3750高壓蒸汽滅菌器及SIM-F140AY65型制冰機(jī)，蘇州虎丘影像科技有限公司的HQ-350XT自動洗片機(jī)等。

1.3 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)前夜用0.1 mg/ml的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板備用。取新生1 d的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下斷頭。剪開頭皮、頭骨，暴露腦區(qū)視野，用彎鑷小心地夾出新月狀海馬組織。然后，置于冰浴DHank液中，小心輕輕地剝離腦膜和血管并洗數(shù)次。接下來，將組織剪碎成糜狀，移至離心管中，加入等體積的0.25%的胰蛋白酶(終濃度為0.125%)，37℃下消化約10 min，每5分鐘晃動1次。后用完全培養(yǎng)基終止消化，用滴管輕輕吹打呈米糊狀，用網(wǎng)篩過濾，1 000 r/min，離心10 min。棄上清，加入完全的培養(yǎng)基，重懸成單細(xì)胞懸液。最后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后5%完全培養(yǎng)基全量換液，48 h加入終濃度10 μmol/L阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過度生長，以后每2～3 d半量換液。培養(yǎng)5～7 d，即可進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體免疫組化染色，對海馬神經(jīng)元進(jìn)行純度鑒定，待神經(jīng)元生長狀態(tài)和密度適中時，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MyD88 siRNA Oligo的設(shè)計(jì)合成 以大鼠MyD88基因序列(PubMed-GenBank NM_198130.1)和siRNA序列選擇原則為依據(jù)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成3對針對MyD88的siRNA Oligo，并同時合成與MyD88基因無任何同源性的negative control(NC)做陰性對照，及帶有羧基熒光素的FAM-siRNA用以檢測轉(zhuǎn)染效率，見表1。

1.5 siRNA oligo的轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元的檢測及優(yōu)化

1.5.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測 將原代海馬神經(jīng)元以0.5×105～2×105的級別接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至5～7 d全量換液成50 μl無血清培養(yǎng)基，以備明日轉(zhuǎn)染用。取1 μl/孔轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTMRNAiMA加入50 μl無血清培養(yǎng)基中稀釋，輕輕混勻并室溫孵育 5 min;取1 μl/孔 FAM-siRNA再加入50 μl無血清培養(yǎng)基中輕輕混勻;將上述的兩種稀釋液體輕輕混勻，室溫孵育約20 min形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液;將混合液加入到預(yù)處理的24孔培養(yǎng)板中混勻續(xù)培養(yǎng);37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，即可檢測轉(zhuǎn)染效率。用Hochest染色細(xì)胞核，以計(jì)量細(xì)胞總數(shù)。在熒光顯微鏡下觀測FAM和Hochest陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.5.2 siRNA序列選擇 將原代海馬神經(jīng)元接種于6孔培養(yǎng)板中，分空白對照、陰性對照、siRNA1、siRNA2和siRNA3共5組。按上述方法將相應(yīng)siRNA序列轉(zhuǎn)染入各分組(終濃度:30 nmol/L，終體積2.5 ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，RT-qPCR測定Myd88阻斷效率。采用相對定量的方式分析RT-qPCR的結(jié)果，以監(jiān)測不同siRNA片段對Myd88基因的沉默效果，選出最佳沉默系列。Trizol法提取神經(jīng)元總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以1.0 μl cDNA 模版，5.0 μl SYBR Green 聚合酶系，0.2 μl引物，3.8 μl nuclease-free Water為反應(yīng)體系，通過Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR System擴(kuò)增MyD88，同時以β-actin為內(nèi)參照。采用相對定量的方式分析RT-qPCR的結(jié)果，選出最佳系列。

1.5.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)然條件 將篩選的最佳siRNA序列，以0、10、20、30、40、50 nmol/L的終濃度，按上述方法轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按上述方法進(jìn)行RT-qPCR的檢測，測定海馬神經(jīng)元Myd88 mRNA的表達(dá)情況，以監(jiān)測不同濃度點(diǎn)siRNA片段對Myd88基因的沉默效果，選出最優(yōu)轉(zhuǎn)染濃度。將篩選的最佳siRNA序列，以篩選的最優(yōu)濃度，按上述方法轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，分別培養(yǎng) 0、24、48、72、96 h 后終止，按上述方法進(jìn)行RT-qPCR的檢測，測定海馬神經(jīng)元Myd88 mRNA的表達(dá)情況，以監(jiān)測不同時間點(diǎn)siRNA片段對Myd88基因的沉默效果，以選出最優(yōu)作用時間。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)分為分空白對照和陰性對照、LPS和siRNA 4組，其中陰性對照組轉(zhuǎn)染的是與MyD88基因無任何同源性的siRNA序列;LPS組采用的方法是以10 μg/ml LPS刺激海馬神經(jīng)元4 h;siRNA組是以上述3.3篩選的最佳siRNA序列，以選出的最優(yōu)濃度和時間點(diǎn)轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，并以10 μg/ml LPS刺激海馬神經(jīng)元4 h。

1.6.1 RT-qPCR法檢測海馬神經(jīng)元TRAM和TRIF mRNA的表達(dá) 將上述的4組提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，Real-Time PCR System分別擴(kuò)增TRAM和TRIF基因，同時以β-actin為內(nèi)參照。采用相對定量的方式分析RT-qPCR的結(jié)果及相應(yīng)基因的表達(dá)水平，見表2。

1.6.2 Western印跡法測定海馬神經(jīng)元TRIF蛋白的表達(dá) 將上述4組海馬神經(jīng)元提取細(xì)胞總蛋白，用Western印跡的方法研究TRIF蛋白的表達(dá)情況。具體操作如下:制備聚10%和12%聚丙烯酰胺凝膠;蛋白樣本的變性、電泳1.5 h;轉(zhuǎn)膜2 h;5%脫脂奶粉封閉至少2 h;孵育I抗4℃冰箱過夜;1×TBST溶液洗膜，室溫孵育Ⅱ抗1 h;1×PBST溶液洗膜，ECL暗室顯影，自動洗片機(jī)洗片。Western印跡膠片掃描成圖片后，用Quantity One4.6.2軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)量，再以各組目的蛋白的相對表達(dá)量與空白對照組的相對表達(dá)量之比，將其標(biāo)準(zhǔn)化，最后用SPSS17.0和Origin7.5軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.6.3 ELISA法測定海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清TRAM、IP-10和IL-1β的水平 收集上述4組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液，每組6個樣本，共24個。用ELISA法分別檢測其所含TRAM、IP-10和IL-1β因子的濃度。

2 結(jié)果

2.1 siRNA oligo轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元的檢測及優(yōu)化

2.1.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測 利用RNAi技術(shù)，將FAM-siRNA轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元。熒光顯微鏡下，黃綠色熒光為FAM標(biāo)記轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，藍(lán)色熒光為Hochest染色細(xì)胞的胞核。結(jié)果顯示，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染效率達(dá)94.3%，見圖1。

圖1 FAM-siRNA轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元(×100)

2.1.2 siRNA片段篩選 siRNA片段經(jīng)RNAi技術(shù)，轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元。RT-qPCR的結(jié)果顯示，在相同轉(zhuǎn)染條件下，與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA1組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA2、3組均能降低海馬神經(jīng)元Myd88 mRNA的表達(dá)量(P＜0.01)。其中以siRNA2組Myd88 mRNA的表達(dá)量下降最明顯。由此可見，將siRNA片段沉默海馬神經(jīng)元Myd88基因的手段成功，且siRNA2的效果最佳，見表3。

表1 不同siRNAs序列

表2 RT-qPCR引物序列

表3 不同siRNAs序列的MyD88基因沉默效果(±s)

表3 不同siRNAs序列的MyD88基因沉默效果(±s)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與陰性對照組比較:2)P＜0.01

組別 ΔCT ΔΔCT RQ(2－ΔΔCT )空白對照組8.434 3±0.327 2 9.000 0±0.000 0 1.000 0±0.000 0陰性對照組 8.292 3±0.400 6 －0.142±0.579 6 1.167 0±0.494 8 siRNA1 組 8.950 0±0.229 4 0.516 0±0.507 4 0.730 0±0.274 9 siRNA2 組 10.954 3±0.482 5 2.520 0±0.725 9 0.190 7±0.104 41)2)siRNA3 組 10.356 7±0.300 7 1.922 7±0.586 0 0.277 7±0.100 11)2)

2.1.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件

2.1.3.1 最佳作用濃度篩選 siRNA2經(jīng)RNAi技術(shù)，轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元。RT-qPCR測定結(jié)果顯示，Myd88 mRNA的表達(dá)隨siRNA2濃度的增加而先下降后升高，在30 nmol/L的終濃度時達(dá)最低RQ為0.164 3;20 nmol/L(RQ為0.177 3)與30 nmol/L組相比，Myd88 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，與0、10、40、50 nmol/L 組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.000 0、0.238 7、0.242 0、0.353 7，P ＜0.05)。

2.1.3.2 最佳作用時間篩選 siRNA2經(jīng)RNAi技術(shù)，轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元。RT-qPCR測定結(jié)果可示，Myd88 mRNA的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染時間的延長而先下降后升高，在48 h時達(dá)最低(RQ低至0.140 3)，48 h組與24 h(RQ為0.267 7)組相比，Myd88 mRNA 的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，與0、72、96 h組比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.000 0、0.190 3、0.277 7，P ＜0.05)。

2.2 海馬神經(jīng)元TRIF的表達(dá)

2.2.1 RT-qPCR法測定海馬神經(jīng)元TRIF mRNA的表達(dá) 空白對照組海馬神經(jīng)元可以表達(dá)TRIF mRNA(1.000 0±0.000 0);在應(yīng)用RNAi技術(shù)使MyD88基因沉默的同時，siRNA組仍然有 TRIF mRNA的表達(dá)(1.648 3±0.168 3);LPS組(1.767 0±0.086 8)與siRNA組TRIF mRNA的表達(dá)均顯著增高，且與空白對照組和陰性對照組(1.045 7±0.075 4)相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2.2 Western印跡法測定海馬神經(jīng)元TRIF蛋白的表達(dá) 正常海馬神經(jīng)元可以表達(dá)TRIF蛋白(1.000 0±0.000 0);在應(yīng)用RNAi技術(shù)使MyD88基因沉默的同時，siRNA組仍然有TRIF蛋白的表達(dá)(1.359 4±0.113 6);LPS組(1.354 3±0.115 0)與siRNA組TRIF蛋白的表達(dá)均上調(diào)，且與空白對照組和陰性對照組(1.031 7±0.089 5)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P ＜0.01)，見圖2。

2.3 海馬神經(jīng)元TRAM的表達(dá)

2.3.1 RT-qPCR法檢測海馬神經(jīng)元TRAM mRNA的表達(dá) 空白對照組海馬神經(jīng)元可以表達(dá)TRAM mRNA;siRNA組在MyD88基因沉默的同時，仍然有RQ為1.423的TRAM mRNA的表達(dá)，LPS(RQ為1.514)與siRNA組TRAM mRNA的表達(dá)均顯著增高，且與空白對照組和陰性對照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3.2 ELISA法檢測海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液中TRAM的表達(dá)空白對照組海馬神經(jīng)元上清液有一定濃度的TRAM(2 001.326 7 pg/ml);在相同轉(zhuǎn)染條件下，與空白對照組相比，陰性對照組上清中TRAM濃度也相對增高(達(dá)2 578.906 7 pg/ml)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);LPS與siRNA組TRAM濃度分別高達(dá) 3464.1817pg/ml和3 417.243 3 pg/ml，與空白對照組和陰性對照組組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 海馬神經(jīng)元TRIF蛋白的表達(dá)

2.4 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IP-10和IL-1β的濃度 正常海馬神經(jīng)元上清液可有一定量的IP-10和IL-1β因子的存在;在相同轉(zhuǎn)染條件下，NC組上清中IP-10和IL-1β濃度也相對增高(P＜0.01);LPS組 IP-10和 IL-1β的濃度明顯增大(P＜0.01)，且與空白對照組和陰性對照組比較差異顯著(P＜0.01);siRNA組IP-10和IL-1β的上清水平較空白對照組和陰性對照組明顯升高，但I(xiàn)L-1β濃度低于LPS組。見表4。

表4 培養(yǎng)上清液中IP-10和IL-1β的濃度(±s，n=10)

表4 培養(yǎng)上清液中IP-10和IL-1β的濃度(±s，n=10)

與空白的對照組比較:1)P＜0.01;與陰性對照組比較:2)P＜0.01;與LPS組比較:3)P＜0.01

組別 IP-10(pg/ml) IL-1β(ng/L)空白對照組74.921 7±9.239 0 17.231 7±0.660 6陰性對照組 145.115 0±3.014 41) 28.760 0±0.637 91)LPS 組 176.433 3±7.712 71)2) 38.790 0±0.592 11)2)siRNA 組 178.321 7±8.049 41)2)34.266 7±2.205 881)2)3)

3 討論

TLR4所介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在AD等ND中的作用更是當(dāng)今科學(xué)研究的焦點(diǎn)。但TLR4在海馬神經(jīng)細(xì)胞中的作用機(jī)理至今還不是很清楚。因此，TLR4激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的探究成為當(dāng)今科研的熱點(diǎn)。

原來人們認(rèn)為，MyD88對于TLR4激活是必不可少的，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MyD88缺陷小鼠仍然能對LPS的刺激反應(yīng)，且炎癥相關(guān)因子的表達(dá)不受影響〔4，5〕，這提示TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不只有MyD88依賴性途徑，還有MyD88非依賴途的存在。那么MyD88非依賴途的究竟是如何發(fā)揮作用的呢?

在海馬神經(jīng)元TLR4激活后的MyD88非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，分別通過核因子(NF)-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子-3(IRF3)通路來進(jìn)行信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。且后者主要通過激活的TLR4，依次活化TRAM和TRIF導(dǎo)致IRF3的激活，進(jìn)而釋放IP-10，炎癥因子TNF-α、IL-1β和NO等。在該通路中，TRAM、TRIF為 TLR4信號所特有，僅參與TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并不參與其他TLRs成員的 MyD88 非依賴型途徑〔3，5〕。因此，TRAM、TRIF 和 IP-10 的水平增高可反映MyD88非依賴型途徑的激活。

首先本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了特異性針對MyD88基因的siRNA序列，經(jīng)脂質(zhì)體途徑轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MyD88基因的表達(dá)，達(dá)到阻斷MyD88依賴型途徑而凸顯非依賴途徑作用的目的。為了直觀上確定所設(shè)計(jì)siRNA序列能否確實(shí)導(dǎo)入海馬神經(jīng)元，將帶有熒光標(biāo)記的FAM-siRNA轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，并用Hochest胞核染色。熒光顯微鏡下結(jié)果顯示，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染效率達(dá)94.3%。這表明siRNA序列可以通過脂質(zhì)體途徑成功的轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元。

那么成功轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元的siRNA序列，能產(chǎn)生多大的沉默效率呢?本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了3對針對MyD88基因的siRNA序列，并同時合成與MyD88基因無任何同源的NC做陰性對照。RT-qPCR結(jié)果顯示，siRNA2、3組 MyD88 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)，且siRNA2沉默效率最高，達(dá)81%。這說明，siRNA序列設(shè)計(jì)成功，通過脂質(zhì)體途徑沉默海馬神經(jīng)元MyD88基因的手段可行，siRNA2為最佳沉默序列。

為了使siRNA2發(fā)揮更好的阻斷效能，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的設(shè)計(jì)以篩選出最佳作用濃度和時間。RT-qPCR結(jié)果可見，在相同轉(zhuǎn)染條件下，Myd88 mRNA的表達(dá)隨siRNA2濃度的增加而先升下降后升高，在30 nmol/L的終濃度時達(dá)最低;隨轉(zhuǎn)染時間的延長而先下降后升高，在48 h達(dá)最低。siRNA2在終濃度30 nmol/L和時間48 h達(dá)到最優(yōu)阻斷效果，這為接下來的研究打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

TRIF在TLR4激活后的MyD88非依賴性途徑中發(fā)揮重要作用〔6〕。TRIF可以在 TLR4激活后，通過一系列反應(yīng)可使IRF3活化，而IRF3能與干擾素激活反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)包括IP-10在內(nèi)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而釋放IP-10，炎癥因子TNF-α、IL-1β和NO等參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。最近研究發(fā)現(xiàn)，TRIF為TLR4信號所特有，僅參與TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并不參與其他TLRs成員的MyD88非依賴型途徑〔3〕。因此，推斷TRIF水平增高可反映MyD88非依賴型途徑的激活。可提示，TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不只有MyD88依賴性途徑的存在，還有MyD88非依賴途徑的存在，LPS可以通過刺激TLR4激活下游的MyD88非依賴途徑，并促進(jìn)TRIF基因和蛋白的表達(dá)。

研究顯示，TRAM是連接TRIF和TLR4的轉(zhuǎn)接蛋白〔7〕，由此可在不依賴MyD88的情況下激活I(lǐng)RF-3，引起下游因子IP-10等的表達(dá)釋放。因此推斷TRAM水平增高也可反映MyD88非依賴型途徑的激活。本實(shí)驗(yàn)可提示，TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不只有MyD88依賴性途徑的存在，還有MyD88非依賴途徑的存在，LPS可以通過刺激TLR4激活下游的MyD88非依賴途徑，并促進(jìn)TRAM基因的表達(dá)，更加深入地驗(yàn)證了MyD88非依賴途徑的存在，同時LPS可以通過刺激TLR4激活下游的MyD88非依賴途徑，促進(jìn)TRAM蛋白的釋放。

TRIF和TRAM是TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的新成員，對它們的研究剛剛起步，仍然有許多環(huán)節(jié)是不知的。研究和探索TRIF和TRAM結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及作用機(jī)制，為TLR4激活后MyD88非依賴通道的研究提供重要的理論依據(jù)，也為ND發(fā)病機(jī)制與防治研究帶來新的曙光。

IP-10是由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類可以趨化淋巴細(xì)胞的CXC類趨化因子。組織損傷時，IP-10能夠趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等到損傷部位發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，IP-10與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系:IP10可增強(qiáng)神經(jīng)元及角質(zhì)細(xì)胞的抗病毒免疫應(yīng)答效能;星型膠質(zhì)細(xì)胞可以合成和釋放IP-10;腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞亦可產(chǎn)生IP-10〔8〕，產(chǎn)生IP-10又可通過趨化炎性細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)而促進(jìn)炎性病灶形成及擴(kuò)大，加重腦組織損傷。

IL-1是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的，介導(dǎo)免疫細(xì)胞間相互作用，傳遞免疫信息的一種多效細(xì)胞因子，包括IL-1α和IL-1β兩種形式。IL-1可在局部或全身發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，如發(fā)熱、促進(jìn)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、促進(jìn)傷口愈合、刺激造血功能等。研究發(fā)現(xiàn)，在AD腦中也有IL-1的存在，且IL-1與AD的發(fā)病有密切的關(guān)系:可加重Aβ的沉積，同時過度堆積的Aβ又可反過來刺激炎癥因子的表達(dá)與釋放，形成惡性循環(huán)，加重AD病情;可能加重AD的膽堿能神經(jīng)功能障礙〔9〕;促進(jìn)神經(jīng)毒性物質(zhì)的釋放(如NO、鈣超載)，從而可能加重神經(jīng)元損傷，推動AD發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IP-10和IL-1β是參與MyD88非依賴途徑相關(guān)炎癥因子，LPS可以通過激動海馬神經(jīng)元TLR4增加IP-10和IL-1β的分泌，而在AD等ND的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮積極作用。

綜上所述，特異性構(gòu)建針對MyD88基因的siRNA序列，能夠通過脂質(zhì)體途徑成功的轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，發(fā)揮很強(qiáng)的沉默效率，達(dá)到理想的阻斷MyD88依賴型途徑而研究非依賴途徑作用。采用 LPS刺激海馬神經(jīng)元，激活 TLR4后，與 MyD88非依賴途徑相關(guān)因子 TRAM、TRIF、IP-10和 IL-1β的表達(dá)量，無論在基因或是蛋白水平上均明顯增高。本研究表明，RNAi可以應(yīng)用于海馬神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，TLR4激活后存在MyD88非依賴途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，海馬神經(jīng)元TLR4介導(dǎo)的MyD88非依賴信號通路的激活，能引起神經(jīng)自身炎癥反應(yīng)，從而在神經(jīng)炎癥中起作用。這些也為ND的預(yù)防和治療提供新實(shí)驗(yàn)依據(jù)和防治靶標(biāo)。

1 王海坤，韓代書.Toll樣受體(TLRs)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與免疫調(diào)節(jié)〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006;33(9):820-7.

2 Finlay BB，Hancock RE.Can innate immunity be enhanced to treat microbial infection〔J〕?Nature Rev Micorbiology，2004;6(2):497-504.

3 Yamamoto M，Sato S，Hemmi H，et al.Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway〔J〕.Science，2003;301(5633):640-3.

4 Hoebe K，Du X，Georgel P，et al.Identification of LPS2 as a key transducer of MyD88 independent TIR signaling〔J〕.Nature，2003;424:743-8.

5 Yamamoto M，Sato S，Hemmi H，et al.Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4〔J〕.Nature，2002;420:324-9.

6 Kawai T，Akira S.TLR signaling〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(5):816-25.

7 Fitzgerald KA，Rowe DC，Barnes BJ，et al.LPS-TLR4 signaling to IRF-3/7 and NF-kappaB involves the toll adapters TRAM and TRIF〔J〕.J Exp Med，2003;198(7):1043-55.

8 Campbell JJ，F(xiàn)oxman EF，Butcher EC.Chemoattractant receptor cross talk as a regulatory mechanism in leukocyte adhesion and migration〔J〕.Eur J Immunol，1997;27:2571-8.

9 Li Y，Liu L，Kang J，et al.Neuronal-glialinteractions mediated by interleukin-1 enhance neuronal acetylcholinesterase activity and mRNA expression〔J〕.J Neurosci，2000;20(1):149-55.