丁 健 李 丹 龔敏貞 王錦坡 吳 婷 王承黨

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 福州 350005)

諸多胃癌患者就診時(shí)已經(jīng)處于腫瘤晚期，失去了手術(shù)和化療機(jī)會(huì)〔1〕。尋找新的腫瘤標(biāo)記物對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷和分期是臨床迫切需要解決的問題和難題。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的發(fā)現(xiàn)為這個(gè)問題的解決提供了新思路和研究方向。目前多數(shù)研究者認(rèn)為，lncRNAs可能在基因表達(dá)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如在神經(jīng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞株中抑制lncRNA的表達(dá)可以有效地抑制細(xì)胞增殖〔2，3〕。本研究嘗試使用lncRNA芯片和qPCR技術(shù)尋找胃癌新的腫瘤標(biāo)記物，并判斷此標(biāo)記物與胃癌臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol試劑和雙鏈cDNA合成試劑盒購自美國Life Technologies公司。PrimeScript?1ststrand cDNA合成試劑盒，日本TaKaRa生物公司。人 lncRNA 4×180 k表達(dá)芯片(包含37 000人lncRNAs和34 000 mRNA探針)和雙鏈cDNA標(biāo)記試劑盒購自北京博奧生物技術(shù)公司。LightCycler Brilliant SYBR Green qRT-PCR試劑盒，美國invitrogen公司。Agilent G2565CA芯片掃描儀，美國Agilent公司。引物由上海生工生物公司合成。其他試劑為進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 lncRNAs表達(dá)芯片篩選胃癌組織lncRNAs表達(dá) 2例胃癌標(biāo)本和癌旁組織取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院術(shù)中標(biāo)本。手術(shù)標(biāo)本于手術(shù)切除后迅速放入液氮，并存于－80℃冰箱備用。取100 mg胃癌組織和癌旁組織，加1 ml的Trizol RNA抽提試劑，按照試劑說明抽提總RNA。將樣品測定RNA在分光光度計(jì)260 nm、280 nm及230 nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。使用雙鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈互補(bǔ)cDNA;使用博奧公司DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行雙鏈互補(bǔ)DNA的標(biāo)記，使用分光光度計(jì)檢測熒光標(biāo)記效率，以保證后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，將雙鏈cDNA與人lncRNA芯片進(jìn)行雜交。雜交后清洗，使用Agilent G2565CA芯片掃描儀進(jìn)行掃描。掃描數(shù)據(jù)使用Genespring GX11軟件進(jìn)行處理(Agilent公司產(chǎn)品)。不同表達(dá)基因使用隨機(jī)變量模型進(jìn)行處理。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分層聚類分析。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測人胃癌標(biāo)本PVT1的表達(dá) 31例胃癌標(biāo)本和癌旁組織取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年10月至2013年11月胃癌手術(shù)標(biāo)本。取100 mg胃癌組織和癌旁組織，加1 ml的Trizol RNA抽提試劑，按照試劑說明抽提總RNA。檢測樣品RNA在分光光度計(jì)260 nm、280 nm及230 nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。抽取1.0 μg總RNA合成cDNA，使用PrimeScript?1ststrand cDNA合成試劑盒進(jìn)行操作。使用LightCycler Brilliant SYBR Green qRT-PCR試劑盒對(duì)PVT1進(jìn)行定量表達(dá)，操作按照說明書進(jìn)行。引物自行設(shè)計(jì)并合成，序列:5’ttggcacatacagccatcat和 3’gcagtaaaaggggaacacca，總qPCR產(chǎn)物長度為102 bp。使用人β-actin基因表達(dá)對(duì)每例樣本PVT1表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。β-actin基因引物:5’agcgagcatcccccaaagtt和 3’gggcacgaaggctcatcatt，產(chǎn)物全長 285 bp。上述qPCR反應(yīng)使用溶解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用秩和分析及四格表χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 lncRNAs表達(dá)芯片篩選胃癌組織中高表達(dá)lncRNAs 部分lncRNAs在胃癌組織中高表達(dá)，其中PVT1在2例胃癌組織中表達(dá)量分別是癌旁組織的5.128和5.755倍，見圖1，表1。

2.2 qPCR檢測胃癌組織和癌旁組織PVT1表達(dá)的差異 胃癌組織中PVT1表達(dá)明顯高于癌旁組織P=0.041 4，見圖2。

2.3 PVT1表達(dá)和胃癌患者臨床特征的關(guān)系 按照PVT1在成對(duì)胃癌和癌旁組織中表達(dá)的高低分為PVT1高表達(dá)組(胃癌PVT1表達(dá)/癌旁PVT1表達(dá)＞2)和PVT1低表達(dá)組(胃癌PVT1表達(dá)/癌旁PVT1表達(dá)＜0.5)。PVT1高表達(dá)與患者的年齡、性別、局部浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分型都沒有相關(guān)性(P＞0.05)，與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P=0.022 0)，見表2。

表1 胃癌組織中高表達(dá)的lncRNAs，共36個(gè)(合并不同探針對(duì)同一分子的檢測)

圖1 lncRNAs表達(dá)芯片對(duì)胃癌和癌旁組織中l(wèi)ncRNAs表達(dá)的檢測結(jié)果

圖2 31例胃癌組織中PVT1表達(dá)差異比較

表2 PVT1表達(dá)和胃癌患者臨床特征的關(guān)系(n)

3 討論

PVT1是原癌lncRNAs之一。PVT1基因的長度大于300 kb，位于MYC下游57 kb處，兩者共同定位于人類染色體8q24〔4，5〕。盡管PVT1不能產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但由于其特殊的定位仍然引起了研究者的注意。PVT1和MYC基因異位與Burkitt淋巴瘤密切相關(guān)〔6〕。有研究者證明在逆轉(zhuǎn)錄病毒所致的小鼠T細(xì)胞淋巴瘤中，PVT1產(chǎn)生的microRNA產(chǎn)物——mmumiR-1204表達(dá)明顯升高，mmu-miR-1204進(jìn)而可以導(dǎo)致P53基因水平升高，并引起P53依賴的細(xì)胞死亡，可能是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制〔7〕。如果乳腺癌和結(jié)腸癌等患者M(jìn)YC和PVT1同時(shí)出現(xiàn)高表達(dá)，往往預(yù)示著病情發(fā)展快，病人預(yù)后差〔8，9〕。故而研究者認(rèn)為PVT1的地位可能和MYC類似，兩者發(fā)揮協(xié)調(diào)作用。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示PVT1在2例胃癌組織中均有高表達(dá)，qPCR結(jié)果顯示，在胃癌組織中PVT1表達(dá)較癌旁組織明顯升高，提示PVT1高表達(dá)可以作為胃癌新的特異性標(biāo)志物。進(jìn)一步顯示PVT1高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，提示PVT1高表達(dá)可以作為胃癌患者伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)志物。臨床工作中，如果胃癌患者標(biāo)本檢測到高表達(dá)PVT1應(yīng)警惕有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可能性。

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