史利利，蔣彩英，于威，陳琛，蔣磊，鞏成見，童富淡

（浙江理工大學生命科學學院，浙江省家蠶生物反應器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州310018）

BmNPVorf98對家蠶核型多角體桿狀病毒復制、轉(zhuǎn)錄及包裝的影響

史利利，蔣彩英，于威，陳琛，蔣磊，鞏成見，童富淡＊

（浙江理工大學生命科學學院，浙江省家蠶生物反應器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州310018）

為了研究家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因orf98的功能，通過λRed重組系統(tǒng)定點敲除BmNPVorf98基因，構(gòu)建缺失型重組病毒Bm98－ko－Bacmid；以Bac－to－Bac系統(tǒng)補回BmNPVorf98基因，構(gòu)建補回型重組病毒Bm98－re－Bacmid；將野生型病毒（wtBacmid）、缺失型病毒（Bm98－ko－Bacmid）和補回型病毒（Bm98－re－Bacmid）分別轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN．病毒滴度檢測結(jié)果顯示，Bm98－ko－Bacmid可形成侵染性的病毒粒子，但數(shù)量顯著降低（P＜0．05）．透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bm98－ko－Bacmid只產(chǎn)生游離的桿狀病毒粒子，數(shù)量明顯減少，而wtBacmid和Bm98－re－Bacmid產(chǎn)生大量具有囊膜結(jié)構(gòu)的成熟病毒粒子．熒光定量聚合酶鏈反應分析結(jié)果表明，BmNPVorf98基因缺失對BmNPV病毒復制沒有影響，而早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（P＜0．05）．綜上所述，BmNPVorf98基因?qū)Σ《緩椭剖欠潜匦璧?，但顯著影響病毒的繁殖速度和包裝（P＜0．05）；對病毒各個時期的基因轉(zhuǎn)錄也具有重要影響．

家蠶核型多角體病毒；λRed重組系統(tǒng)；Bac－to－Bac系統(tǒng)；病毒復制；基因轉(zhuǎn)錄

Journal of Zhejiang University（Agric．＆Life Sci．），2015，41（6）：623－630

SummaryBaculoviruses have been considered as the powerful vectors to express the exogenous gene．And the representative vectors in baculovirus expression vector system is Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）and Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）．The AcMNPV expression system has been widely applied in American and European countries．However，the BmNPV expression reaches a higher level over other systems，because BmNPV can infect silkworm larva or pupa．Moreover，silkworm is pretty normal in China，with lower cost and mature breeding technology，thus it is really popular to use the silkworm as a“biofactory＂to produce recombinant protein．The BmNPV genome sequenced in 1999was 128 413nucleotides long with a G＋C content of 40%and contained about 136open reading frames（ORFs）encoding predictedproteins of over 60amino acids．

The gene of BmNPVorf98 is found in all GroupⅠand the most of GroupⅡgenomes．It is not a highly conserved gene，as the deletion of this gene in BmNPV，it has no apparent effect on infectivity．The function of BmNPVorf98 has not been reported until now．In order to study the specific function of BmNPVorf98 gene，a BmNPVorf98 knockout bacmid byλRed recombination was constructed，naming Bm98－ko－Bacmid．Additionally，Bm98－re－Bacmid was constructed by Bac－to－Bac system．BmN cells were infected with three kinds of virus DNA from wild－type bacmid（wtBacmid），Bm98－ko－Bacmid and Bm98－re－Bacmid，and the cells were respectively collected in 12h，24h，48hand 72hphases，then virus titer（50%tissue culture infective dose，TCID50）was determinated and virus proliferation curve was drawn，and total DNA was extracted using a eukaryotic DNA extraction kit．After DpnⅠenzyme digestion overnight，the effects of lacking BmNPV orf98 gene on virus replication and transcription were analyzed by fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）．

The results showed that the knockout bacmid was able to produce viral progeny after transfecting the DNA of Bm98－ko－Bacmid into BmN cells，but the number of viral progeny reduced significantly（P＜0．05）；meanwhile，the virus infection level of repair was recovered which was similar with that of wild－type virus，indicating that the virus infection level in the incidence of BmN cells could be delayed after the deletion of BmNPVorf98．Assembly of virus was observed by transmission electron microscope in 48hphase．The results indicated that，after 48hof transfecting host cell，wtBacmid and Bm98－re－Bacmid viruses produced a large number of virus－packed capsule membrane except the BmNPVorf98 knockout virus．The BmNPVorf98 deletion didn’t show significantly effects on viral DNA replication，suggesting that it was not essential for viral replication；however，the transcription of early gene lef3，late gene vp39 and very late gene p10 decreased obviously（P＜0．05），because of lack of BmNPV orf98 gene．

All the above results show that BmNPV orf98 gene is non－essential for viral replication，but it can significantly affect viral progeny and assembly，and lack of the gene will lead to significant decline of the transcription level of early gene lef3，late gene vp39 and very late gene p10．

桿狀病毒是有囊膜包被的雙鏈閉環(huán)超螺旋DNA病毒，在自然環(huán)境中專一感染節(jié)肢動物，產(chǎn)生的病毒粒子呈桿狀，其基因組大小在80～180kb之間［1］；根據(jù)其形態(tài)特征分為顆粒體病毒屬（granuloviruses，GVs）和核型多角體病毒屬（nucleopolyhedroviruses，NPVs）．其中，核型多角體病毒［2－3］主要以2種形式存在：一種為包涵體衍生型病毒（occlusion－derived virus，ODV），它主要存在于環(huán)境中的植物表面，被昆蟲吞食后在中腸的堿性條件下才會釋放出來，并穿過食膜結(jié)合到中腸柱狀上皮細胞的微小絨毛上［4］；另一種是芽生型病毒（budded virus，BV），它主要是病毒侵染個體細胞時由細胞產(chǎn)生的一種芽生病毒，可直接感染鄰近細胞［5－6］．

家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedroviruses，BmNPV）是核型多角體病毒屬典型代表之一，其基因組大小為128 413bp，能編碼蛋白質(zhì)（60個氨基酸殘基以上）的開放閱讀框約有136個［7］．BmNPVorf98基因編碼82個氨基酸［8］，其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為9 500；它不是桿狀病毒的核心基因，該基因的插入或缺失對BmNPV病毒侵染性沒有明顯影響［9］，但該基因?qū)Σ《緩椭坪娃D(zhuǎn)錄的影響至今未見報道．因此，為了研究BmNPVorf98基因功能，本文通過λRed重組系統(tǒng)［10－14］和Bac－to－Bac系統(tǒng)［15－16］分別構(gòu)建了Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid；將野生型wtBacmid、缺失型Bm98－ko－Bacmid和補回型Bm98－re－Bacmid病毒分別轉(zhuǎn)染BmN細胞，通過滴度檢測和透射電鏡掃描分析病毒的增殖和裝配，同時以熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）分析［17］BmNPVorf98基因缺失對BmNPV的復制以及病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉(zhuǎn)錄水平的影響．

1 材料與方法

1．1 材料

家蠶細胞BmN、大腸埃希菌（Escherichia coli）

TG1、DH10Bac（含Helper和pKD46質(zhì)粒）、轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB和pKD46質(zhì)粒等（均由浙江理工大學生物化學與分子生物學實驗室保存）；胎牛血清和sf－900TMⅡSFM（1×）（Life Technologies公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Roche公司）；DpnⅠ酶、KOD高度保真酶、BmHⅠ、XhoⅠ快速內(nèi)切酶、r Taq酶、T4DNA連接酶和DL15000／2000標志物（Takara公司）；SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒（Promega公司）．所有特異性引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司檢測．

1．2 方法

1．2．1擴增打靶片段 根據(jù)NCBI提供的BmNPVorf98的開放閱讀框，設計擴增引物Bm98－C（5′－ATGAGCATTTTAAACGTTGTAGAAGC GTGCGATTTGGCACACACTGTGTAGGCTGGA GCTGCTTC－3′）和Bm98－N（5′－CATTCTGTAGT TTTTTTGTTTAGCATGACTGCCACTTCCTTT ATGATGGGAATTAGCCATGGTCC－3′）．其中，下劃線為BmNPVorf98基因的同源臂（45bp），未劃線部分為氯霉素的同源區(qū)（20bp）．以pKD3質(zhì)粒為模板，擴增特異性打靶片段Bm98－Cm（約1 100 bp）．

1．2．2構(gòu)建缺失型病毒Bm98－ko－Bacmid 利用Primer Premier 5．0設計并合成鑒定引物Bm98－F（5′－CGGGATCCATGAGCATTTTAAACGTT－3′）和Bm98－R（5′－CCGCTCGAGTCATTTGATAGTGT AAAT－3′），氯霉素基因內(nèi)部的1對引物Vlf－F（5′－CACGTTTAAATCAAAACTGGTG－3′）和Vlf－R（5′－CAATATGGACAACTTCTTCG－3′）．

將打靶片段Bm98－Cm轉(zhuǎn)化到含有pKD46質(zhì)粒的DH10Bac感受態(tài)細胞中，以L－阿拉伯糖誘導DH10Bac中pKD46質(zhì)粒產(chǎn)生重組酶，使打靶片段Bm98－Cm與BmNPVorf98發(fā)生重組，利用抗性平板（Kan和Cm）篩選出陽性單克隆菌落，構(gòu)建缺失型病毒Bm98－ko－Bacmid，并用合成的2對引物Bm98－F／R和vlf－F／R進行PCR鑒定．

1．2．3構(gòu)建補回型病毒Bm98－re－Bacmid 利用Primer Premier 5．0和Oligo生物信息學軟件，設計并合成鑒定引物M13－F（5′－GTTTTCCCAGTCA CGAC－3′）和M13－R（5′－CAGGAAACAGCTATG AC－3′）．根據(jù)NCBI提供的BmNPVorf98基因以及前后基因序列設計引物Bm98－F1（5′－CGGGATCCTCAGGCGACACGGTGGATT－3′）和Bm98－R1（5′－CCGCTCGAGCCTTACAACAAAC ACGAAG－3′）（下劃線處分別為BmHⅠ和XhoⅠ酶切位點）．擴增補回片段Bm98（包括BmNPV orf98基因的開放閱讀框和自身啟動子序列261 bp），將該片段連接到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacHTB－Bm98，并將其轉(zhuǎn)化到缺失型病毒的感受態(tài)細胞中，在Bac－to－Bac系統(tǒng)作用下，將BmNPVorf98基因異位補回到多角體啟動子下游，用抗性平板（Kan、Gen、Tet、IPTG和X－gal）篩選陽性菌落，構(gòu)建補回型病毒Bm98－re－Bacmid．用Bm98－F1／R1引物和M13引物進行交叉PCR鑒定．

1．2．4病毒滴度測定 收集4個時相（12、24、48和72h）的3種病毒（wtBacmid、Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid），按照1×10－1～1×10－10的梯度進行稀釋，分別取100μL加入到96孔板家蠶細胞BmN中，每個稀釋度8個重復，以不加任何病毒的正常細胞作為對照．4～5d后根據(jù)每個梯度發(fā)病數(shù)目計算半數(shù)組織細胞感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50）值［18］．

1．2．5電子顯微鏡觀察病毒粒子包裝 將3種病毒（wtBacmid、Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid）分別轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，收集48h時相的細胞，通過固定、包埋、切片和染色進行透射電鏡觀察［19］．

1．2．6BmNPVorf98缺失對BmNPV病毒基因組復制的影響 gp41是BmNPV包涵體來源病毒囊膜的結(jié)構(gòu)蛋白基因，是熒光定量PCR檢測的標記基因．根據(jù)gp41基因序列，利用Primer Premier 5．0設計并合成引物gp41F（5′－CGTAGTGGTAG TAATCGCCGC－3′）和gp41R（5′－AGTCGAGTCG CGTCGCTTT－3′），β－actinF（5′－GCGCGGCTACT CGTTCACT－3′）和β－actinR（5′－TGCCGCAAGCT TCCATACCC－3′）．

各取1μg wtBacmid、Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid病毒DNA，分別轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，分別在4個時相（12、24、48和72h）收集細胞，并參照DNA試劑盒說明書提取細胞總DNA，用DpnⅠ酶消化過夜．用β－actin作為內(nèi)參進行熒光定量PCR，3次重復．

1．2．7BmNPVorf98缺失對家蠶桿狀病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響 利用Primer Premier 5．0和Oligo 6．0軟件設計并合成引物β－actinF（5′－GCGCGGC TACTCGTTCACTACC－3′）和β－actinR（5′－TGCCGCAAGCTTCCATACCC－3′），lef－3F（5′－TCGGA TGACCGTTCTACCTCTT－3′）和lef－3R（5′－CTT CCAGCAGCATTGAGATTTG－3′），vp39F（5′－AG ACACCACAAACCCGAACAC－3′）和vp39R（5′－T TGATCGCCAACACCACCT－3′），p10F（5′－TTGA TCGCCAACACCACCT－3′）和p10R（5′－CGATTC TTCCAGCCCGTTT－3′）．

各取1μg wtBacmid、Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid病毒DNA，分別轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，收集4個時相（12、24、48和72h）的細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行熒光定量PCR，分析BmNPVorf98基因缺失對早期基因lef3［20］、晚期基因vp39［21］和極晚期基因p10［22］轉(zhuǎn)錄水平的影響，3次重復．

2 結(jié)果

2．1 缺失型病毒和補回型病毒的鑒定

2．1．1打靶片段的鑒定 以pKD3為模板、Bm98－C／N為引物進行PCR，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 100bp左右有1條清晰的特異性條帶（圖1），與理論值一致．將該基因序列送生工生物工程（上海）股份有限公司檢測，結(jié)果表明該基因序列完全正確，未發(fā)生堿基突變．

圖1 打靶片段擴增Fig．1 Amplification of target gene

2．1．2Bm98－ko－Bacmid的鑒定 將抗性平板（Kan和Cm）篩選出的陽性單克隆菌落用2對引物進行交叉擴增，引物組合Vlf－F／Bm98－R、Bm98－F／ Vlf－R和Bm98－F／R擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 172、325和887bp處均出現(xiàn)特異性條帶 （圖2），與理論值一致．表明成功構(gòu)建了Bm98－ko－Bacmid．

圖2 Bm98－ko－Bacmid的PCR鑒定Fig．2 Identification of Bm98－ko－Bacmid by PCR

2．1．3Bm98－re－Bacmid的鑒定 將抗性平板（Kan、Gen、Tet、IPTG和X－gal）篩選出的陽性單克隆菌落用2對引物M13－F／R和Bm98－F1／R1進行交叉PCR鑒定，引物組合M13－F／R、M13－F／Bm98－R1和Bm98－F1／M13－R擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在3 100、2 178和1 128bp處均出現(xiàn)單一特異性條帶（圖3），與理論值一致．表明成功構(gòu)建了Bm98－re－Bacmid．

2．2 BmNPVorf98缺失對BmNPV病毒增殖和包裝的影響

病毒滴度檢測結(jié)果（圖4）顯示：在12h時相，3種病毒的滴度都為0；隨著時間延長，3種病毒的TCID50隨之增大，缺失型的病毒滴度顯著低于補回型和野生型的病毒滴度（P＜0．05），補回型與野生型的病毒滴度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）．說明BmNPVorf98基因的缺失影響了病毒BV的產(chǎn)生量，推遲了細胞的發(fā)病時間．在72h時相，野生型與補回型病毒滴度一致，說明這種缺陷可以通過基因補回而得到恢復，所以BmNPVorf98基因不是病毒增殖的必需基因，但顯著影響病毒的增殖速度．

收集48h的病毒轉(zhuǎn)染細胞并制樣，通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野生型和補回型病毒產(chǎn)生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子，而缺失型病毒僅形成游離態(tài)桿狀病毒粒子，囊膜包裝的成熟病毒粒子少見（圖5）．

圖3 Bm98－re－Bacmid的PCR鑒定Fig．3 Identification of Bm98－re－Bacmid by PCR

圖4 病毒增殖曲線Fig．4 Virus growth curve in the transfected BmN cells

2．3 BmNPVorf98缺失對BmNPV病毒復制的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，3種病毒基因組復制水平均隨轉(zhuǎn)染時間延長而提高，但在同一時相3種病毒基因組復制水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（圖6）．表明BmNPVorf98的缺失不影響病毒基因組的復制，該基因不是病毒復制的必需基因．

2．4 BmNPVorf98缺失對BmNPV病毒不同時期基因轉(zhuǎn)錄的影響

圖5 病毒轉(zhuǎn)染家蠶細胞48h后的裝配情況Fig．5 Assembly of BmN cells transfected with three kinds of viruses for 48h

圖6 病毒復制水平的實時熒光定量PCR分析Fig．6 Fluorescent quantitative PCR analysis of viral DNA replication

從圖7可以看出：wtBacmid、Bm98－ko－Bacmid和Bm98－re－Bacmid病毒分別轉(zhuǎn)染家蠶細胞后，這3種病毒的轉(zhuǎn)錄水平隨著轉(zhuǎn)染時間延長而增大；在轉(zhuǎn)染48和72h時相，BmNPVorf98基因的缺失導致早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（P＜0．05），但補回型與野生型基因轉(zhuǎn)錄水平基本一致，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）．說明該種缺陷可以通過基因補回予以恢復．

3 討論

傳統(tǒng)BmNPV載體構(gòu)建和篩選主要通過將外源基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體病毒啟動子的多克隆位點上，然后將其與病毒DNA同步轉(zhuǎn)入昆蟲細胞，經(jīng)過空斑鑒定和分析進行病毒純化．該過程不僅過程煩瑣，耗時長，并且重組率低下，同時篩選時也需要豐富的經(jīng)驗和專業(yè)知識［23－25］．Red重組系統(tǒng)需設計2對引物，即帶同源臂的抗性基因擴增引物和鑒定引物．帶同源臂的抗性基因擴增引物可以擴增兩側(cè)帶有FRT位點的抗性基因片段，并在FRT位點的外側(cè)加入同源臂，其擴增產(chǎn)物通過同源重組將抗性片段替換以敲除目的基因，構(gòu)建缺失型病毒Bm98－ko－Bacmid；在Bac－to－Bac系統(tǒng)中穿梭質(zhì)粒Bacmid包含mini－F復制子、卡那霉素抗性篩選標記和細菌轉(zhuǎn)座子Tn7的靶位點以及編碼β－半乳糖苷酶A肽的部分DNA片段．將含有外源基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞（該細胞含有桿狀病毒穿梭載體、復制子以及LacZ肽段編碼基因），輔助質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶使供體質(zhì)粒中的外源基因通過轉(zhuǎn)座插入到桿狀病毒基因組中，破壞LacZ的表達．用含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X－gal的培養(yǎng)板篩選，重組病毒基因組轉(zhuǎn)化體菌落呈白色，即補回型病毒Bm98－re－Bacmid．該過程歷時較短，成功率高，與傳統(tǒng)方法比有著較大的優(yōu)勢．

圖7 不同時期基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig．7 Transcription level analysis of lef－3，vp39 and p10 genes in different periods

文獻報道lef－9［26］和gp88［27］是BmNPV形成有感染活性病毒粒子BV的必需基因，lef－9或gp88缺失病毒都不能產(chǎn)生有感染活性的BV，補回型病毒感染活性恢復．而本研究表明：BmNPV orf98基因缺失后BmNPV病毒仍能夠形成侵染性的病毒粒子，但數(shù)量降低．透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，lef－9或gp88基因的缺失都影響了病毒的裝配能力，不產(chǎn)生具有侵染性的BV，而BmNPVorf98的缺失僅抑制病毒粒子增殖和病毒粒子的包裝，這種缺陷都可以通過基因的補回來彌補，BmNPVorf98的抑制作用機制有待深入研究．gp88基因的缺失使病毒基因組DNA的復制水平明顯降低，而BmNPV orf98和lef－9的缺失不影響病毒基因組的DNA復制，BmNPVorf98和lef－9都不是病毒復制的必需基因．BmNPVorf98、lef－9和gp88缺失都導致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（P＜0．05），三者對BmNPV基因組轉(zhuǎn)錄的作用相似，但它們的作用機制是否相同還有待進一步研究．

4 結(jié)論

病毒滴度檢測和透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，BmNPVorf98缺失可抑制BmNPV病毒的增殖和包裝．熒光定量PCR分析結(jié)果表明：BmNPV orf98的缺失不影響B(tài)mNPV的病毒基因組復制；而早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平因BmNPVorf98基因的缺失而顯著降低（P＜0．05），將BmNPVorf98基因補回后恢復到野生型水平，說明該種缺陷可以通過基因的補回來彌補．

（References）：

［1］ Nie Y，Theilmann D A．Deletion of AcMNPV AC16and AC17results in delayed viral gene expression in budded virus infected cells but not transfected cells．Virology，2010，404（2）：168－179．

［2］ Hamajima R，Ito Y，Ichikawa H，et al．Degradation of rRNA in BM－N cells from the silkwormBombyx mori during abortive infection with heterologous nucleopolyhedroviruses．Journal of General Virology，2013，94（Pt 9）：2102－2111．

［3］ Ishihara G，Shimada T，Katsuma S．Functional characterization of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus CG30 protein．Virus Research，2013，174（1／2）：52－59．

［4］ Tang Q，Li G H，Yao Q，et al．Bm91 is an envelope component of ODV but is dispensable for the propagation of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus．Journal of Invertebrate Pathology，2013，113（1）：70－77．

［5］ Dickison V L，Willis L G，Sokal N R，et al．Deletion of AcMNPVac146 eliminates the production of budded virus．Virology，2012，431（1／2）：29－39．

［6］ Chen H，Li M，Mai W，et al．Analysis of BmNPVorf101 disruption：orf101 is essential for mediating budded virus production．Cytotechnology，2014，66（6）：1021－1029．

［7］ Zhang M J，Cheng R L，Lou Y H，et al．Disruption of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF71（Bm71）results in inefficient budded virus production and decreased virulence in host larvae．Virus Genes，2012，45（1）：161－168．

［8］ Gomi S，Majima K，Maeda S．Sequence analysis of the genome of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus．Journal of General Virology，1999，80（Pt 5）：1323－1337．

［9］ Ono C，Kamagata T，Taka H，et al．Phenotypic grouping of 141BmNPVs lacking viral gene sequences．Virus Research，2012，165（2）：197－206．

［10］ Katsuma S，Shimada T．Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF34is required for efficient transcription of late and very late genes．Virology，2009，392（2）：230－237．

［11］ Pacholska－Bogalska J，Myga－Nowa M，Ciepluch K，et al．Analysis of the coding sequence and expression of the coiledcoil alpha－h(huán)elical rod protein 1gene in normal and neoplastic epithelial cervical cells．International Journal of Molecular Medicine，2012，29（4）：669－676．

［12］ Wang Q，Guo Z J，Yao Q，et al．Rapid disruption of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus orf60 by Red recombination system．Chinese Journal of Biotechnology，2007，23（5）：801－805．

［13］ Okano K，Vanarsdall A L，Rohrmann G F．Characterization of a baculovirus lacking the alkaline nuclease gene．Journal of Virology，2004，78（19）：10650－10656．

［14］ Hou S W，Chen X W，Wang H Z，et al．Efficient method to generate homologous recombinant baculovirus genomes in E．coli．Preparative Biochemistry，2002，32（4）：783－784，786，788．

［15］ Li X H，Wang D，Zhou F，et al．Cloning and expression of a cellulase gene in the silkworm，Bombyx mori by improved Bac－to－Bac／BmNPV baculovirus expression system．Molecular Biology Reports，2010，37（8）：3721－3728．

［16］ Xiang X W，Yang R，Yu S F，et al．Construction of a BmNPV polyhedrin－plus Bac－to－Bac baculovirus expression system for application in silkworm，Bombyx mori．Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87（1）：289－295．

［17］ Yu W，Du C Y，Quan Y P，et al．Characterization of late gene expression factor LEF－10from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus．Virus Research，2013，175（1）：45－51．

［18］ McIntosh A H，Ignoffo C M，Andrews P L．In vitro host range of five baculoviruses in lepidopteran cell lines．Intervirology，1985，23（3）：150－156．

［19］ Xiang X W，Chen L，Guo A Q，et al．The Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）ODV－E56envelope proteinis also a per os infectivity factor．Virus Research，2011，155（1）：69－75．

［20］ Yu M，Carstens E B．Identification of a domain of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus single－strand DNA－binding protein LEF－3essential for viral DNA replication．Journal of Virology，2010，84（12）：6153－6162．

［21］ Danquah J O，Botchway S，Jeshtadi A，et al．Direct interaction of baculovirus capsid proteins VP39and EXON0 with kinesin－1in insect cells determined by fluorescence resonance energy transfer－fluorescence lifetime imaging microscopy．Journal of Virology，2012，86（2）：844－853．

［22］ Liang X，Lu Z L，Wei B X，et al．Phylogenetic analysis of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus polyhedrin and p10 genes in wild isolates from Guangxi Zhuang Autonomous Region，China．Virus Genes，2013，46（1）：140－151．

［23］ 曹翠平．家蠶新型高效桿狀病毒表達系統(tǒng)的開發(fā)和應用研究．杭州：浙江大學，2007：11－14．Cao C P．Development of a novel BmNPV expression vector system using silk worm as bioreactor and the application．Hangzhou：Zhejiang University，2007：11－14．（in Chinese with English abstract）

［24］ 邵純君．重組桿狀病毒高效篩選方法的建立．遼寧，大連：大連理工大學，2008：8－10，45．Shao C J．The establishment of a high－effective select strategy for recombinant baculovirus．Dalian，Liaoning：Dalian University of Technology，2008：8－10，45．（in Chinese with English abstract）

［25］ 費偉強，陳琴，陳倩，等．復制缺陷型BmNPV載體的構(gòu)建及初步應用．蠶業(yè)科學，2013（3）：514－521．Fei W Q，Chen Q，Chen Q，et al．Construction and preliminary application of replication－deficient BmNPV vectors．Science of Sericulture，2013（3）：514－521．（in Chinese with English abstract）

［26］ 石楊輝．家蠶桿狀病毒晚期表達因子Lef－9的功能研究．杭州：浙江理工大學，2013：30－31，42．Shi Y H．Functional studies on Bombyx mori nucleopolyhedrovirus polyhedrin late expression factor of Lef－9．Hangzhou：Zhejiang Sci－Tech University，2013：30－31，42．（in Chinese with English abstract）

［27］ 張臣．BmNPV DNA結(jié)合蛋白GP88對病毒復制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究．杭州：浙江理工大學，2013：31，39，47，56．Zhang C．Study on the viral replication and transcription of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus DNA－binding protein GP88．Hangzhou：Zhejiang Sci－Tech University，2013：31，39，47，56．（in Chinese with English abstract)

作者投稿時請?zhí)峁╅_放研究者與貢獻者身份識別碼

開放研究者與貢獻者身份識別碼（Open Researcher and Contributor Identifier，ORCID）是由湯森路透和自然出版集團等單位于2009年共同發(fā)起創(chuàng)建的，其意義與科學文獻領域的數(shù)字對象唯一標識符（Digital Object Identifier，DOI）類似．DOI為科技文獻的身份證，一文一證；ORCID為科研人員的學術身份證，一人一證．作者使用ORCID可促進其研究成果的可視化，有利于研究成果的傳播．

若尚未獲取ORCID的作者請先登錄http：／／orcid．org，進入網(wǎng)站注冊后免費獲取ORCID．本刊從2015年第4期起在作者信息欄添加ORCID，即http：／／orcid．org／后16位數(shù)字．如某作者ORCID為0000－0002－5115－1154，請將該ORCID添加到本刊在線投稿系統(tǒng)的作者信息備注欄中，并在投稿論文首頁頁腳作者姓名后加上http：／／orcid．org／0000－0002－5115－1154．

——浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版）編輯部

Influence of BmNPVorf98 on DNA replication，transcription and virus package of Bombyx morinucleopolyhedrovirus．

Shi Lili，Jiang Caiying，Yu Wei，Chen Chen，Jiang Lei，Gong Chengjian，Tong Fudan＊

（Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biological Medicine in Zhejiang，College of Life Sciences，Zhejiang Sci－Tech University，Hangzhou 310018，China）

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus；λRed recombination system；Bac－to－Bac system；viral replication；gene transcription

Q 78；S 884．5

A

10．3785／j．issn．1008－9209．2015．01．191

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100603）．

童富淡（http：／／orcid．org／0000－0003－0813－0072），Tel：＋86－571－86843193，E－mail：fdtong＠zstu．edu．cn

聯(lián)系方式：史利利（http：／／orcid．org／0000－0002－4587－7426），E－mail：15757184377＠163．com

2015－01－19；接受日期（Accepted）：2015－03－26；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期

日期（Published online）：2015－11－18

URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／33．1247．s．20151118．1648．010．html