王青松，柳永，王新，孫宏，姚曉紅，吳逸飛，湯江武＊，葛向陽(yáng)＊

（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，杭州310021）

基于質(zhì)構(gòu)量化分析的凈水菌膠囊制備及其性能研究

王青松1，柳永2，王新2，孫宏2，姚曉紅2，吳逸飛2，湯江武2＊，葛向陽(yáng)1＊

（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，杭州310021）

為提高凈水菌劑的應(yīng)用性能，通過(guò)固定化包埋處理，以實(shí)心載菌膠囊為研究模型，以質(zhì)構(gòu)量化分析數(shù)據(jù)為主要篩選依據(jù)，通過(guò)不同輔料配方和制作工藝對(duì)膠囊的硬度、黏聚性和彈性恢復(fù)進(jìn)行比較研究，以篩選出較佳的輔料配方和加工工藝，并對(duì)較佳配方的載菌膠囊進(jìn)行斷面形貌觀察、孔隙率測(cè)定、菌劑釋放率測(cè)定和氨氮模擬污水凈化實(shí)驗(yàn)．結(jié)果表明：較佳成囊壁材配方為V（4%海藻酸鈉）∶V（10%聚乙烯醇）＝1∶9，固化液配方為4% H3BO4和4%CaCl2混合溶液，輔料硅藻土、沸石粉和竹炭的適宜添加量分別為20%～30%、20%～80%和20%～60%；膠囊為多孔結(jié)構(gòu)，單獨(dú)添加硅藻土、沸石粉、竹炭或三者混合添加下，膠囊微觀結(jié)構(gòu)存在差異，其中硅藻土、沸石粉和竹炭經(jīng)包埋后比表面積和孔容均減小，孔徑變化不大；24h內(nèi)膠囊中菌劑的水體釋放率較低，為1%～14%；載菌膠囊在模擬污水凈化實(shí)驗(yàn)中，20h后各實(shí)驗(yàn)組氨氮質(zhì)量濃度從1h時(shí)的39．3～44．7mg／L降低到0．1mg／L以下，其中未經(jīng)包埋的菌株直接投放組降低最快，其次為混合1組［V（4%海藻酸鈉）∶V（10%聚乙烯醇）＝1∶9，海藻酸鈉和聚乙烯醇總體積10mL＋硅藻土1．5g＋沸石粉0．5g＋竹炭0．5g＋菌懸液2mL］和竹炭組，同時(shí)，總氮也出現(xiàn)不同程度的降低．總之，該研究采用的質(zhì)構(gòu)量化分析方法為凈水菌固定化載體研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐，研究獲得的優(yōu)化膠囊體系在質(zhì)構(gòu)和凈水能力方面均表現(xiàn)出良好的性能，在環(huán)境污染水體微生物凈化治理方面具有較大的應(yīng)用潛力．

載菌膠囊；質(zhì)構(gòu)量化分析；內(nèi)部結(jié)構(gòu)；混合比例；氨氮降解

Journal of Zhejiang University（Agric．＆Life Sci．），2015，41（6）：712－722

SummaryThe technology for microorganism immobilization originated from the immobilized enzyme technology in the 1970s．After decades of development，it has been widely used in food fermentation and environmental protection，etc．Especially，microbe－embedded capsules have drawn substantial attentions fromresearchers due to their significant roles in water purification and sewage treatment．However，lack of consolidated standards has impeded their applications．Texture profile analysis（TPA）has been widely used in food industry for determination of product structure and quality，while its application in non－food field is yet to be explored．Therefore，in the present study，TPA was used for the development and optimization of bacteria－embedded solid capsule systems in the purpose of water purification．

To achieve this purpose，solid capsules were prepared with different materials，such as diatomite，zeolite powder and bamboo charcoal in different blending ratios．TPA was employed to characterize these capsules in respects of hardness，cohesiveness and elastic resilience（springiness）．Meanwhile，scanning electron microscopy（SEM）was adopted to investigate the sectional structure and pore size of these capsules．Furthermore，simulative experiments in both ultrapure water and sewage were carried out to examine the releasing velocity and water purification efficiency of these bacteria－embedded solid capsules．Combining with TPA and SEM，the factors influencing the internal structure of capsules including embedding／crosslinking medium，curing duration，and ingredient proportions were explored，thus providing standards and guidelines for the preparation of bacteriaembedded capsules for large－scale practical applications in the future．

The TPA data showed that a high ratio of sodium alginate in the embedding medium resulted in capsules with high strength，and polyvinyl alcohol rendered cohesiveness and resilience（springiness）to capsules．An optimal embedding medium system was established as follows：V（4%sodium alginate）∶V（10%polyvinyl alcohol）＝1∶9for embedding medium，while the mixture of 4%boric acid and 4%calcium chloride for crosslinking medium．The optimal concentrations of various materials were determined as follows：20%－30%for diatomite，20%－80%for zeolite powder and 20%－60%for bamboo charcoal．The optimal curing duration varied from 16 to 36h．The SEM images indicated the existence of internal microspores both at nanoscale and micron－size in the crosslinked capsules，and differences on microstructures of capsules were observed among single or combining addition of diatomite，zeolite powder and bamboo charcoal．Both specific surface area and pore volume decreased after embedding，but not for pore size．The releasing rates of bacteria in capsules in 24hwere low，from 1%to 14%．In the simulative experiments of the sewage purification，all groups，including bacteria－embedded capsule and free bacteria，showed good ammonia removal efficiency．The final concentration of ammonia was below 0．1 mg／L after 20h，while the initial concentration was 39．3－44．7mg／L．The bacteria－free group had the highest ammonia removal efficiency，followed by mixture 1group（1mL of 4%sodium alginate，9mL of 10%polyvinyl alcohol，1．5g diatomite，0．5g zeolite powder，0．5g bamboo charcoal，and 2mL bacterial culture）and bamboo charcoal group．Meanwhile，the total nitrogen concentration decreased at a certain degree．These results confirmed that these capsules were applicable for sewage treatment．

In conclusion，the present study establishes successfully standards and guidelines for the preparation of bacteria－embedded capsules on the basis of TPA in combination with SEM and simulative experiments．This profound step can accelerate the practical application of bacteria－embedded capsules in actual sewage purification．

微生物在水體污染物降解中扮演著無(wú)可替代的重要角色，其對(duì)有機(jī)物的礦化轉(zhuǎn)化、對(duì)氮素的轉(zhuǎn)化和反硝化脫除以及對(duì)磷的聚集固化是實(shí)現(xiàn)污染水體凈化的重要的天然機(jī)制．2013年浙江省地表水省控?cái)嗝姹O(jiān)測(cè)顯示的主要污染物——氨氮、石油類和總磷［1］均涵蓋在微生物凈化能力范疇之內(nèi)．如何激活或強(qiáng)化微生物對(duì)特定污染物的凈化能力，是開(kāi)展污染水體生物治理研究的重要方向．

已有的污染水體微生物修復(fù)研究報(bào)道多見(jiàn)于環(huán)境處理微生物菌株的篩選和開(kāi)發(fā)利用方面，多種微生物菌劑如球菌、假單孢菌、寡養(yǎng)假單孢菌、枯草芽孢桿菌等［2－6］已被應(yīng)用于環(huán)境污水的治理中［7－8］．相比直投游離菌劑，固定化菌劑具有微生物密度高、便于培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌群、加工穩(wěn)定性高、環(huán)境耐受力強(qiáng)、可定點(diǎn)釋放、發(fā)揮作用突出以及節(jié)約人力成本等優(yōu)點(diǎn)，因而獲得了越來(lái)越多的重視．已見(jiàn)報(bào)道的菌劑載體材料研究包括：陳慧英［9］制作了天然菌絲球載體，Lin等［10］以棉纖維為吸附載體用于石油污染處理，Liu等［2］以改性竹炭為固定化載體用于硝酸鹽的去除，Zhou等［11］以復(fù)合聚氨酯泡沫為固定化載體用于Cu2＋的去除，Bai等［12］制作了多孔交聯(lián)聚乙烯醇泡沫作為菌劑載體，Partovinia等［13］則采用凍融法制備了多孔聚乙烯醇菌劑載體材料，王興南［14］制備了多孔型懸浮載體材料，等．菌劑包埋方式由最初的簡(jiǎn)單吸附發(fā)展為吸附、包埋、交聯(lián)、截留等多種形式［15］．此外，也有一系列用于環(huán)境治理的高效生物反應(yīng)器見(jiàn)于報(bào)道，如Zhao等［16］開(kāi)發(fā)的曝氣生物濾池（biological aerated filter，BAF），Xiao等［6］研發(fā)的AYC生物反應(yīng)系統(tǒng)和Tong等［17］開(kāi)發(fā)的固定化生物濾器，等．而上述凈水菌劑負(fù)載體系對(duì)材料性能的評(píng)估主要采用硬度測(cè)定以及感官評(píng)定的方式進(jìn)行，量化數(shù)據(jù)指標(biāo)較少，質(zhì)構(gòu)性能表征不全面．質(zhì)構(gòu)分析（texture profile analysis，TPA）儀是一種感官量化測(cè)定儀器，主要用于對(duì)食品物性特點(diǎn)做出數(shù)據(jù)化的準(zhǔn)確表述，能夠從硬度、黏聚性以及彈性恢復(fù)3個(gè)方面對(duì)物體進(jìn)行質(zhì)構(gòu)量化分析．完善的硬度、黏聚性和彈性恢復(fù)測(cè)試數(shù)據(jù)，為載菌輔料配方的篩選和制作工藝的優(yōu)化提供了更科學(xué)可靠的量化依據(jù)，有利于高性能菌劑載體的獲得．本文基于質(zhì)構(gòu)量化分析開(kāi)展了凈水菌劑的固定化包埋研究，獲得了較佳的輔料配方和制作工藝，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)載菌膠囊進(jìn)行了形貌觀察、孔隙率測(cè)定以及模擬氨氮污水凈化實(shí)驗(yàn)．

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)菌株 W13菌株和蠟樣芽孢桿菌，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境污水中篩選獲得，具有高效降解氨氮和總氮的生理活性．

1．1．2 主要實(shí)驗(yàn)藥品 海藻酸鈉、聚乙烯醇（聚合度1 750±50）和檸檬酸鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CaCl2購(gòu)自Bio Basic公司（德國(guó)）；H3BO4購(gòu)自杭州市高晶精細(xì)化工有限公司；竹炭（80目）購(gòu)自四川省成都市郫縣神火木炭有限公司，硅藻土（200目）購(gòu)于浙江省嵊州市華力硅藻土制品有限公司，沸石粉（50目）購(gòu)自鄭州市凱嵐水處理材料有限公司（這3種輔料使用前均經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理）；胰蛋白胨和酵母提取物均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．氨氮模擬污水配方（1L）：NH4Cl 0．191g、檸檬酸鈉2．94g、MgSO4· 7H2O 0．2g、NaCl 0．5g、K2HPO45．0g、KH2PO41．5g、微量元素液1mL、ddH2O 999mL，121℃高壓滅菌30min，冷卻后待用．其中，微量元素液配方（1L）：乙二胺四乙酸50g、CaCl25．5g、ZnSO42．2 g、MnCl2·4H2O 5．06g、FeSO4·7H2O 5．0g、（NH4）6Mo7O24·H2O 1．1g、CuSO4·5H2O 1．57 g、CoCl2·6H2O 1．61g、ddH2O 1 000mL，調(diào)節(jié)pH至7．0．

1．1．3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 物性質(zhì)構(gòu)儀（TA－XTPlus，英國(guó)SMSTA公司）；物理吸附儀（ASAP 2010C，美國(guó)Micromeritics公司）；掃描電子顯微鏡（S－4700，日本Hitachi公司）；離心機(jī)（Sigma 3K18，德國(guó)Sigma公司）；高壓滅菌鍋（GI54D，美國(guó)Zealway公司）．

1．2 方法

1．2．1 膠囊體系的建立和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1．2．1．1 成囊壁材成分和固化液配方篩選．成囊壁材配方溶液：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的海藻酸鈉水溶液（于60℃水浴溶解）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的聚乙烯醇水溶液（現(xiàn)制現(xiàn)用），將海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液按照一定體積比混合獲得5種成囊壁材溶液（A～E），即V（海藻酸鈉）∶V（聚乙烯醇）＝9∶1，5∶1，1∶1，1∶5和1∶9．固化液配制：將H3BO4和CaCl2按一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)和比例溶解于ddH2O水中，獲得3組交聯(lián)劑配方溶液，即1＃：1%H3BO4和4%CaCl2混合溶液，2＃：4%H3BO4和4%CaCl2混合溶液，3＃：4%H3BO4和1%CaCl2混合溶液，滅菌備用．

將A～E 5種成囊壁材溶液混合均勻后，使用一次性5－mL注射器（去針頭）分別滴入到1＃、2＃和3＃固化液中，通過(guò)體系中海藻酸鈉與Ca2＋、聚乙烯醇與H3BO4分別交聯(lián)固化過(guò)夜制成膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺(tái)瀝干并保存于4℃?zhèn)溆茫∩鲜龈鹘M膠囊進(jìn)行質(zhì)構(gòu)性能測(cè)試，以質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選出較佳的成囊壁材配方和固化液配方．質(zhì)構(gòu)性能測(cè)試的主要參數(shù)如下：測(cè)前、測(cè)中和測(cè)后速度均為1．00mm／s，目標(biāo)模式為距離模式，距離2 mm，保持時(shí)間5s，觸發(fā)模式為自發(fā)模式，觸發(fā)力0．049 03N，探頭為SWS P／2，S＝3．14mm2．從每組樣品中挑選粒徑較均勻（直徑約4～5mm）的5～6粒進(jìn)行測(cè)定．

1．2．1．2 固化液對(duì)負(fù)載微生物的毒性實(shí)驗(yàn)．各取1 mL在LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜的W13菌液，分別與90mL無(wú)菌ddH2O、2＃和3＃固化液混合均勻（根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再對(duì)1＃固化液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)），于室溫下靜置并分別于30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h取樣，采用平板涂布計(jì)數(shù)法進(jìn)行W13活菌計(jì)數(shù)．通過(guò)觀察比較W13活菌數(shù)在固化液接觸條件下是否降低來(lái)判斷固化液對(duì)該菌株是否存在細(xì)胞毒性．

1．2．1．3 多孔輔料對(duì)膠囊質(zhì)構(gòu)性能改善效果實(shí)驗(yàn)．以成囊壁材溶液E為基礎(chǔ)配方，按照每10mL成囊壁材溶液分別添加1．0、2．0、4．0、6．0和8．0g硅藻土、沸石粉或竹炭的比例添加輔料，各體系混合均勻后使用一次性5－mL注射器（去針頭）滴注到2＃固化液中，固化過(guò)夜獲得附加多孔輔料的膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺(tái)瀝去多余水分并進(jìn)行質(zhì)構(gòu)性能測(cè)試，以確定最適的輔料添加量．

1．2．1．4 最適固化時(shí)長(zhǎng)篩選實(shí)驗(yàn)．根據(jù)確定出的最適輔料添加量，以成囊壁材溶液E為基礎(chǔ)配方，分別添加硅藻土2．0g、沸石粉2．0g或竹炭3．0g，各體系混合均勻后使用一次性5－mL注射器（去針頭）滴注到2＃固化液中，分別于1、2、4、8、16、24和36h取樣得到不同固化時(shí)長(zhǎng)的膠囊，使用ddH2O沖洗膠囊后于超凈臺(tái)瀝去多余水分并進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定（方法同1．2．1．1節(jié)），以確定最適的固化時(shí)長(zhǎng)．

1．2．2 載菌膠囊的孔隙率測(cè)定及微觀和宏觀形貌觀察 進(jìn)行孔隙率測(cè)定的微膠囊以成囊壁材溶液E為基礎(chǔ)配方，在10mL包埋壁材體系中輔料總添加量均為2．5g．其中，混合1組：m（硅藻土）∶m（沸石粉）∶m（竹炭）＝3∶1∶1，混合2組：m（硅藻土）∶m（沸石粉）∶m（竹炭）＝2∶1∶2，及3種輔料單一添加實(shí)驗(yàn)組，共5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，將其混合均勻后使用一次性5－mL注射器滴入2＃固化液中固化約16h，制得微膠囊．

1．2．2．1 載菌膠囊孔隙率測(cè)定．取輔料硅藻土、沸石粉、竹炭原料以及1．2．2節(jié)中制備的5組膠囊各2．0g，于烘箱中50℃烘干過(guò)夜作為待測(cè)樣品，根據(jù)氮吸附法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，即取一定量（＞1g）樣品先進(jìn)行脫氣處理（160℃，12h），隨后在液氮溫度下進(jìn)行氮?dú)獾奈摳剑鶕?jù)Brunauer－Emmet－Teller（BET）方程和Barrett－Joyner－Halenda（BJH）模型分別計(jì)算出樣品的比表面積和孔徑分布等數(shù)據(jù)．

1．2．2．2 載菌膠囊掃描電子顯微鏡觀察．取1．2．2節(jié)中制備的膠囊硅藻土組、沸石組、竹炭組，每組各3粒，將膠囊封閉在濾紙中，使用乙醇進(jìn)行梯度脫水干燥：分別將膠囊依次置于30%乙醇，室溫30min；50%乙醇，室溫30min；70%乙醇，室溫30min；80%乙醇，室溫30min；90%乙醇，室溫30min； 100%乙醇，室溫30min，共2次．隨后將膠囊浸于乙酸正戊酯中，15min／次，共2次．最后將膠囊置于干燥通風(fēng)處自然干燥．待樣品干燥、制樣噴金后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察．

1．2．2．3 凈水實(shí)驗(yàn)的膠囊照片．取1．2．2節(jié)中所制的5組膠囊分別置于平板中，使用直尺作為實(shí)物比例尺，使用Nikon D5300相機(jī)進(jìn)行照片拍攝，觀察．1．2．3 膠囊的實(shí)驗(yàn)室模擬凈水實(shí)驗(yàn)和釋放實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行凈水實(shí)驗(yàn)的膠囊實(shí)驗(yàn)組配方見(jiàn)1．2．2節(jié)，與其不同的是在各實(shí)驗(yàn)組中均加入已知濃度的菌懸液2 mL，并計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組膠囊的菌含量．在進(jìn)行模擬凈水實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)膠囊的菌含量對(duì)投菌量進(jìn)行統(tǒng)一．間隔一定時(shí)間取水樣測(cè)定水體中的氨氮和總氮含量．水質(zhì)氨氮采用水楊酸分光光度法測(cè)定，參照HJ 536—2009進(jìn)行［18］；水質(zhì)總氮采用堿性過(guò)硫酸鉀消解－紫外分光光度法測(cè)定，參照HJ 636—2012進(jìn)行［19］．

分別取一定量上述膠囊投于經(jīng)高壓滅菌的超純水和模擬污水中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組總投菌量控制在1．0×107CFU／mL左右，間隔一定時(shí)間后取水樣于超凈臺(tái)上進(jìn)行稀釋涂布平板計(jì)數(shù)，確定水溶液中微生物的數(shù)量．通過(guò)對(duì)比水體中W13的活菌數(shù)判定膠囊中所包埋的微生物是否釋放出以及在模擬污水中是否進(jìn)行了增殖．

膠囊的菌含量計(jì)算方法：先稱量空的平板和注射器（去針頭）質(zhì)量，記為m1（每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立使用平板和注射器，不混用）．將聚乙烯醇和海藻酸鈉加入平板，再將菌懸液依量加入，混勻，最后將輔料加入，體系混勻，稱平板＋注射器（去針頭）＋輔料＋菌懸液質(zhì)量，記為m2．然后進(jìn)行膠囊滴注，將混合均勻的膠囊體系吸入注射器，再將混合體系逐滴滴入裝有4%飽和H3BO4溶液和4%CaCl2的燒杯中，交聯(lián)固化過(guò)夜，稱量殘留有菌懸液及材料的平板和注射器，記為m3．將交聯(lián)固化過(guò)夜的微生物膠囊用ddH2O沖洗3遍，瀝去多余的水分，置于烘箱40℃稍微烘干，稱量最終所得的膠囊質(zhì)量，記為m4．（m2－m3）／（m2－m1）即為制得膠囊中所含菌懸液的比例，已知菌懸液添加量和最終膠囊的質(zhì)量m4便可粗略計(jì)算出膠囊中的菌含量．

2 結(jié)果與分析

2．1 膠囊體系的建立和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1．1 不同混合比例的壁材在不同固化液中制備的膠囊質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果 由表1可知，A、B、C、D和E 5種配方壁材形成的膠囊硬度呈現(xiàn)出A＞B＞C＞D＞E的變化趨勢(shì)，且這一硬度變化趨勢(shì)在1＃、2＃和3＃固化液中均同步出現(xiàn)．由于從A到E配方是海藻酸鈉濃度逐步降低而聚乙烯醇濃度逐步升高的變化過(guò)程，說(shuō)明膠囊硬度與海藻酸鈉濃度呈正相關(guān)，即較高海藻酸鈉濃度對(duì)獲得高硬度膠囊有利，反之則有利于低硬度膠囊的獲得．對(duì)各組別黏聚系數(shù)和彈性（恢復(fù)系數(shù)）的比較（表1）發(fā)現(xiàn)，聚乙烯醇濃度較高的D和E配方中膠囊的黏聚系數(shù)和彈性（恢復(fù)系數(shù)）普遍高于A、B和C等聚乙烯醇濃度較低的配方（1＃中除外，這可能是由于1＃中H3BO4濃度過(guò)低，膠囊壁材體系不能形成有效交聯(lián)），即較高的聚乙烯醇濃度有利于高黏聚系數(shù)和彈性恢復(fù)系數(shù)膠囊的獲得．對(duì)固化液成分與膠囊質(zhì)構(gòu)性能相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，較高的CaCl2濃度有利于海藻酸鈉形成較高硬度的固化物，如海藻酸鈉濃度最高的A配方壁材，在CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的1＃和2＃固化液中形成的膠囊硬度［1＃－A：（3 357．10±355．64）μN(yùn)和2＃－A：（2 313．49±107．51）μN(yùn)］顯著高于其在CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的3＃固化液中所形成的膠囊硬度［3＃－A：（1 771．74±205．41）μN(yùn)］．此外，在CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)同為4%時(shí)，H3BO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的2＃固化液較H3BO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的1＃固化液在A和B壁材配方下所形成的膠囊硬度均顯著降低，這表明H3BO3對(duì)海藻酸鈉固化結(jié)構(gòu)的形成存在較大干擾．比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CaCl2的2＃和3＃固化液中膠囊的黏聚系數(shù)和彈性（恢復(fù)系數(shù)）發(fā)現(xiàn)，CaCl2對(duì)聚乙烯醇的固化結(jié)構(gòu)形成無(wú)顯著性干擾．

表1 不同包埋體系和固化液組合實(shí)驗(yàn)中各組膠囊質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 1 Textural data of capsules prepared with different embedding materials in different curing liquids

2．1．2 固化液對(duì)W13菌株的毒性測(cè)試結(jié)果 由圖1可知：2＃和3＃固化液對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株W13均存在一定的毒性作用，其中，3＃固化液的毒性弱于2＃；用2種固化液處理24h后，W13的存活率均在80%以上．說(shuō)明2＃和3＃固化液均可用于包埋W13膠囊的制備，本實(shí)驗(yàn)中以2＃為佳．以后的實(shí)驗(yàn)可根據(jù)包埋菌劑的不同選擇不同的固化液濃度．

2．1．3 不同材料組合的膠囊質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果 表2顯示：在包埋壁材體積為10mL時(shí)添加硅藻土、沸石粉和竹炭后膠囊硬度均增高，當(dāng)添加量均為4g時(shí)，用這3種輔料制備的膠囊硬度與2．1．1節(jié)中2＃－E組相比，增幅分別為296．25、487．16和22 342．04μN(yùn)，其中竹炭對(duì)膠囊硬度的增強(qiáng)效果最顯著；當(dāng)添加量為1～6g時(shí)，膠囊硬度的升高與添加量的升高呈正相關(guān)，而黏聚性、彈性恢復(fù)與添加量呈負(fù)相關(guān)；當(dāng)竹炭用量進(jìn)一步增加到8g時(shí)，膠囊硬度出現(xiàn)回落，黏聚性和彈性恢復(fù)則進(jìn)一步降低．這表明適宜的添加量有利于較佳膠囊硬度、黏聚性和彈性恢復(fù)的獲得．此外，由于以竹炭作為凈水菌劑載體對(duì)體對(duì)提高凈水性能有一定的增強(qiáng)效應(yīng)［2］，本實(shí)驗(yàn)采用較高的竹炭添加水平．綜上，當(dāng)包埋壁材體積為10 mL時(shí)，硅藻土添加量在2．0～3．0g、沸石粉添加量在2．0～8．0g、竹炭添加量在2．0～6．0g時(shí)，膠囊在各方面的性能均表現(xiàn)良好．

圖1 固化液對(duì)W13菌株數(shù)量的影響Fig．1 Effects of curing liquid on quantity of strain W13

表2 不同材料組合膠囊的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 2 Textural data of microcapsules with different material combinations

2．1．4 在不同固化時(shí)長(zhǎng)下膠囊質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果

從表3可以看出：當(dāng)添加物為硅藻土?xí)r，在固化8～36h期間，膠囊硬度逐漸增加，尤其在固化24h和36h時(shí)，膠囊硬度增加最為顯著，固化36h時(shí)的膠囊硬度較固化1h時(shí)提高了120．5%，表明硅藻土膠囊的理想固化時(shí)間較長(zhǎng)，以16～36h為宜；當(dāng)添加物為沸石粉時(shí)，膠囊的質(zhì)構(gòu)參數(shù)未隨固化時(shí)長(zhǎng)出現(xiàn)規(guī)律性變化，固化36h時(shí)的膠囊硬度較固化1h僅提高了27．9%，表明處理1h以上即可良好固化沸石組膠囊；當(dāng)添加物為竹炭時(shí)，在固化1～8h期間，膠囊硬度逐步升高，在8h時(shí)達(dá)到最高值（21 540．89± 562．13）μN(yùn)，在固化時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)到36h的過(guò)程中，膠囊硬度發(fā)生回落，幅度為14．9%～25．0%，最低硬度為（16 157．65±1 544．68）μN(yùn)．綜合分析認(rèn)為，在混合添加硅藻土、沸石粉和竹炭情況下膠囊固化時(shí)長(zhǎng)以16～36h為宜，膠囊各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)參數(shù)均可保持在較高水平．

表3 在不同固化時(shí)長(zhǎng)下膠囊的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 3 Textural data of microcapsules under different curing time

2．2 膠囊孔隙測(cè)定及微觀和宏觀形貌觀察結(jié)果

2．2．1 膠囊孔隙測(cè)定結(jié)果 由表4可知：在3組材料中以竹炭的比表面積最大，沸石組的平均孔徑最大，在膠囊的內(nèi)部存在很多的小孔，尺寸大小在納米級(jí)別．對(duì)單一輔料膠囊實(shí)驗(yàn)組與原材料孔隙測(cè)定結(jié)果比較可知：各組膠囊的比表面積均有所下降，如硅藻土原材料組比表面積為4．954 9 m2／g，而硅藻土組膠囊比表面積為3．516 0m2／g；孔容也均出現(xiàn)下降，如竹炭原材料組孔容為0．116 7cm3／g，而竹炭組膠囊孔容為0．052 7 cm3／g．這說(shuō)明有部分成囊壁材和微生物被固定于輔料的孔隙中．

表4 膠囊及原材料的孔隙測(cè)定結(jié)果Table 4 Porosity determination result of microcapsules and raw materials

圖2 不同材料組膠囊的掃描電鏡圖Fig．2 Scanning electron micrograph for microcapsules of different materials

2．2．2 膠囊的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果 由圖2可知：實(shí)驗(yàn)所制的膠囊內(nèi)部存在大量微米級(jí)和納米級(jí)空隙，相比硅藻土、竹炭或混合添加組，沸石組膠囊內(nèi)部孔隙較小、交聯(lián)更為密集；在各組膠囊中，菌體細(xì)胞被膠囊內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)攔截而留存于膠囊孔隙中（如圖2中箭頭所示）．膠囊表層的菌體可能會(huì)脫落進(jìn)入外界水體并流失，膠囊內(nèi)部菌體則被截留于膠囊內(nèi)部，能夠定點(diǎn)凈化水體．

2．2．3 膠囊宏觀形貌觀察結(jié)果 圖3所示為進(jìn)行凈水實(shí)驗(yàn)的5組膠囊．各組膠囊顆粒直徑均為4～5mm，硅藻土組為白色膠囊顆粒，竹炭組為黑色膠囊顆粒，沸石組為土黃色膠囊顆粒，混合組為深淺不同的黑色膠囊顆粒．

圖3 進(jìn)行凈水實(shí)驗(yàn)的膠囊形態(tài)Fig．3 Microcapsule form applied in the experiment of water purification

2．3 膠囊中包埋微生物的釋放實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室模擬凈水實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 膠囊在超純水及模擬污水中的釋放統(tǒng)計(jì)

從圖4A可以看出，膠囊中的微生物在釋放到模擬污水環(huán)境后進(jìn)行了增殖，微生物數(shù)量在8h后迅速提高，在16h左右達(dá)到了107數(shù)量級(jí)，菌體總量超過(guò)投加量．從圖4B可以看出：在超純水中，24h內(nèi)W13菌數(shù)始終保持在較低水平，尤其是沸石組（ZP）菌數(shù)最低，相比之下其他各組釋放量略高于沸石組，這與在圖2中觀測(cè)到的ZP組的致密孔隙結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相吻合；各組菌體釋放率為1%～14%．

2．3．2 在凈水實(shí)驗(yàn)中氨氮降解和總氮去除結(jié)果

由圖5A可知：在模擬污水降解實(shí)驗(yàn)中，各膠囊實(shí)驗(yàn)組均能降低模擬污水中的氨氮值；在處理16h時(shí)，各處理組氨氮降解速度為直投（CK）＞混合1組（M1）＞竹炭組（BC）＞混合2組（M2）＝沸石組（ZP）＞硅藻土組（DE）；經(jīng)處理20h時(shí)，各組模擬污水中氨氮值均降低到0．1mg／L以下，降解率達(dá)到99．7%以上．同時(shí)，24h后各實(shí)驗(yàn)組模擬污水中的總氮值均有不同程度的下降，其中，直投組總氮值下降最多，膠囊組中以沸石組和混合1組的總氮值降低較多（圖5B）．

3 討論

圖4 載菌膠囊在人工模擬污水（A）和純水（B）中對(duì)W13菌的釋放Fig．4 Cumulative release of strain W13from microcapsules in artificially simulative sewage（A）and ultrapure water（B）

固定化成囊壁材的性能是影響固定化菌劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素之一，凈水菌劑成囊壁材的強(qiáng)度、透水性、黏聚性和彈性等性能對(duì)菌劑載體形貌和結(jié)構(gòu)的保持，以及凈水應(yīng)用性能的發(fā)揮具有重要意義．本文基于質(zhì)構(gòu)量化分析開(kāi)展了凈水菌劑固定化體系的研究，并獲得了凈水性能較佳的載菌膠囊配方．高濃度聚乙烯醇、低濃度海藻酸鈉壁材配方和竹炭輔料在載菌膠囊穩(wěn)定性和硬度提高上貢獻(xiàn)最大．首先通過(guò)海藻酸鈉和聚乙烯醇的交聯(lián)固化，形成膠囊載體的基礎(chǔ)多孔結(jié)構(gòu)．在海藻酸鈉上α－L－古羅糖醛酸與鈣離子的交聯(lián)為可逆反應(yīng)，在環(huán)境應(yīng)用中比較容易導(dǎo)致載體結(jié)構(gòu)崩潰，但α－L－古羅糖醛酸和CaCl2的交聯(lián)反應(yīng)迅速（約100s），這對(duì)成囊壁材成型有利，且易形成硬度較高的凝膠［20］．聚乙烯醇與H3BO4反應(yīng)形成牢固的化學(xué)鍵［21］，其反應(yīng)速度較慢但在水環(huán)境中穩(wěn)定性好．基于容易成型和高環(huán)境穩(wěn)定性的要求，該研究最終采用高濃度聚乙烯醇－低濃度海藻酸鈉配方制備載菌膠囊壁材．對(duì)高濃度聚乙烯醇壁材配方的選擇，進(jìn)一步?jīng)Q定了適宜的固化液配方為高H3BO4含量的固化液配方．其次，通過(guò)多孔輔料的添加進(jìn)一步改善膠囊載體的質(zhì)構(gòu)性能，尤其在添加竹炭后膠囊硬度增加幅度超過(guò)了40倍，遠(yuǎn)高于同為輕質(zhì)多孔結(jié)構(gòu)的硅藻土．其原因可能與竹炭上攜帶較多-OH 和O基團(tuán)有關(guān)［22］，竹炭上的OH可能參與了聚乙烯醇與H3BO4間的配位聚合反應(yīng)，使得聚乙烯醇鏈得以固定于竹炭顆粒表面從而獲得支撐力，并最終表現(xiàn)為膠囊硬度大幅增高．

圖5 在凈水實(shí)驗(yàn)中氨氮（A）和總氮（B）變化Fig．5 Change of ammonia nitrogen（A）and total nitrogen concentrations（B）in the experiment of water purification

膠囊的凈水效果主要由菌劑的活性決定，菌劑活性的發(fā)揮又與菌劑的存活狀態(tài)密切相關(guān)．在實(shí)驗(yàn)室模擬污水中，游離的W13菌劑對(duì)氨氮和總氮的去除能力均高于其膠囊化包埋固定菌劑，究其原因與包埋處理后膠囊結(jié)構(gòu)對(duì)菌劑與被降解物之間接觸造成的阻礙有關(guān)．對(duì)凈水菌劑固定化包埋的目的是提高其對(duì)流動(dòng)水體的定點(diǎn)凈化治理能力，在能夠保證良好定點(diǎn)治理的基礎(chǔ)上，盡可能高的保持其對(duì)污染物的降解活性是凈水菌劑固定化的主要研究目的．根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算，竹炭組膠囊在16h時(shí)對(duì)氨氮的去除率為直投菌劑的60．7%，混合1組膠囊的79．7%．在該研究中，竹炭組和混合1組載菌膠囊在實(shí)現(xiàn)菌劑良好固定化的同時(shí)，其凈水性能也獲得了較高程度的保持．

4 結(jié)論

該研究基于質(zhì)構(gòu)量化分析進(jìn)行了膠囊壁材、輔料、固化劑和固化時(shí)間等因子的優(yōu)化篩選工作，通過(guò)質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)的量化分析獲得了較佳的凈水菌劑載菌膠囊制備工藝，并開(kāi)展了凈水性能驗(yàn)證工作．結(jié)果表明，基于質(zhì)構(gòu)量化分析獲得的菌劑固定化包埋體系在膠囊機(jī)械性能和凈水性能上均有良好表現(xiàn)．較佳的載菌膠囊體系為4%海藻酸鈉1mL，10%聚乙烯醇9mL，竹炭2．5g或硅藻土、沸石粉和竹炭混合物2．5g（硅藻土1．5g＋沸石粉0．5g＋竹炭0．5 g），菌懸液2mL，混合均勻后于固化液（4%H3BO4和4%CaCl2混合溶液）中固定16～36h即可．在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中可根據(jù)需要制備成球狀、片狀或條狀載菌形式．該研究中良好載菌體系的獲得與基于質(zhì)構(gòu)量化分析的膠囊制備工藝優(yōu)化方法密不可分．建立質(zhì)構(gòu)量化分析方法在凈水菌劑載體研究中的拓展應(yīng)用將對(duì)菌劑載體性能量化評(píng)價(jià)和綜合性能的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)發(fā)揮積極的作用．

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Preparation and performance study of water purification bacteria－embedded solid capsules based on texture profile analysis．

Wang Qingsong1，Liu Yong2，Wang Xin2，Sun Hong2，Yao Xiaohong2，Wu Yifei2，Tang Jiangwu2＊，Ge Xiangyang1＊
（1．State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2．Institute of Plant Protection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

bacteria－embedded capsules；texture profile analysis；internal structure；blending ratio；ammonianitrogen degradation

Q 814．2；X 172

A

10．3785／j．issn．1008－9209．2015．01．291

浙江省國(guó)際合作項(xiàng)目“微納米材料增效凈水活菌膠囊劑研制及應(yīng)用＂（2012C24021）．

＊通信作者（Corresponding authors）：湯江武（http：／／orcid．org／0000－0003－0562－8983），Tel：＋86－571－86404323，E－mail：tangjiangwu＠sina．com；葛向陽(yáng)（http：／／orcid．org／0000－0002－8941－1230），Tel：＋86－27－87281040，E－mail：gxy＠m(xù)ail．hzau．edu．cn

聯(lián)系方式：王青松（http：／／orcid．org／0000－0001－9599－6186），E－mail：weixiaochunfeng＠163．com

2015－01－29；接受日期（Accepted）：2015－04－21；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期（Published online）：2015－09－30

URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／33．1247．S．20150930．1651．002．html