廖梓亙 陳慧

紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中抗氧化作用的研究

廖梓亙 陳慧

目的 探討紅花注射液（SI)在大鼠腦缺血/再灌注損傷中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響。方法 將40只健康SPrague-Dawley大鼠隨機分為假手術組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只，分別在再灌注24h測定超氧化物歧化醉(SOD)活性和丙二醛（MDA）的含量，再灌注24h后取梗死灶腦組織行HE染色。結果 小劑量紅花組和大劑量紅花組SOD活性較缺血/再灌注模型組及假手術組有顯著增強（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的SOD活性增強更明顯（t=79.871,P=0.000）；小劑量紅花組與大劑量紅花組MDA含量較缺血/再灌注模型組及假手術組有顯著減少（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的MDA含量減少更明顯（t=-1.314,P=0.000）。結論 紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中通過增強機體SOD活性,降低MDA含量，達到其保護作用。

大腦中動脈閉塞；紅花注射液；超氧化物歧化酶；丙二醛

急性腦缺血損傷是目前發(fā)病率高、病死率高、致殘率高，嚴重威脅著人類健康的疾病，尋求保護方面的研究是主要目標之一。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷后產(chǎn)生大量氧自由基等炎性因子，從而說明氧化應激機制是腦缺血/再灌注損傷的主要機制之一。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是體內(nèi)的主要氧自由基清除劑之一，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物之一，因此，通過具有清除氧自由基的藥物對缺血/再灌注損傷有神經(jīng)保護作用。

紅花為菊科植物,具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效,是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥,主要成分有紅花苷、紅花素、黃花素和總黃酮等，具有明顯降低腦缺血大鼠腦線粒體MDA含量、升高SOD活性、抑制Ca2+過多攝入[1]，本研究通過觀察不同劑量的紅花對大鼠腦缺血/再灌注損傷后細胞形態(tài)學及SOD活性及MDA含量的影響，探討紅花對腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實驗動物及分組 40只清潔級健康雄性SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200～250g,由南華大學實驗動物中心提供，許可證號：SYYK-025。本實驗研究嚴格參照中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》[2]。40只大鼠隨機分成假手術組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只。

1.2 方法 造模成功后2h小劑量紅花組及大劑量紅花組分別腹腔注射紅花注射液1mL/kg和3mL/kg(山西華衛(wèi)有限公司)；假手術組,缺血/再灌注模型組分別腹腔注射等量的生理鹽水。實驗動物模型的制備及評分參照Koizumi[3]方法制成大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模術后2h觀察大鼠的癥狀和體征,采用Longa[4]評分標準進行。0分：正常（無神經(jīng)功能障礙）；1分：上肢不能完全伸展；2分：爬行時向左側劃圈；3分：爬行時向左側傾倒；4分：無自發(fā)性活動伴意識障礙。剔除0分與4分；符合評分標準，但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術后死亡者，亦予以剔除，并隨機補充。

1.3 腦缺血再灌注后體積的測量 各組SD大鼠腦缺血模型分別在缺血2h后再灌注24h后，再次評分后，深度麻醉后并斷頭取腦，以視交叉和其后4mm處兩點冠狀切片，逐層切成2mm厚的腦片，置于2%的3，5-三苯基氯化四氮唑TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，觀察腦組織：正常腦組織呈紅色，腦缺血組織呈白色。

1.4 HE染色觀察 所有大鼠缺血/再灌注24h后，再次評分，斷頭取腦后，取得的所有腦組織均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋,組織連續(xù)冠狀切片，HE染色。

1.5 SOD活性測定 將各組大鼠經(jīng)心臟取血4mL，4000r/min離心15min，取上清液30μL，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，按試劑盒說明操作。

1.6 MDA含量測定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定。將經(jīng)心臟取血4mL，離心半徑為4cm,離心速度為4000r/ min離心15min，取上清100μL，采用TBA比色法測定MDA含量，按試劑盒說明操作。

1.7 統(tǒng)計學方法 用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用“x±s”表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積的影響 根據(jù)Longa評分，假手術組評分最低，無神經(jīng)功能障礙；缺血/再灌注模型組評分最高，神經(jīng)功能受損最嚴重。小劑量紅花組及大劑量紅花組神經(jīng)功能評分與缺血/再灌注模型組比較有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組神經(jīng)功能評分改善更顯著（t=0.869,P=0.000）。小劑量紅花組及大劑量紅花組腦梗死體積與缺血/再灌注模型組比較，也有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組腦梗死體積改善也更顯著（t=18.276,P=0.000）。見表1。

表1 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積的影響(x±s，n=10)

2.2 HE染色 顯微鏡下可見：假手術組：神經(jīng)細胞胞質(zhì)深染，核仁形態(tài)正常、飽滿；缺血再灌注模型組：神經(jīng)細胞大量變性壞死，細胞間間隙明顯增寬，細胞間質(zhì)空泡改變，細胞稀少，細胞水腫明顯，胞體縮小；小劑量紅花組：神經(jīng)細胞部分變性壞死，存活的神經(jīng)細胞較多，凋亡細胞相對減少，細胞水腫明顯，部分細胞形態(tài)相對正常；大劑量紅花組：神經(jīng)細胞少部分變性壞死，存活的神經(jīng)細胞增多，凋亡細胞減少，多數(shù)細胞形態(tài)正常。見圖1。

圖1 大鼠腦缺血/再灌注損傷24小時腦組織病理組織變化（HE染色×400）

2.3 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的影響 小劑量紅花組、大劑量紅花組SOD活性和缺血/再灌注模型組與假手術組相比較有顯著增高（均P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組SOD活性增高更顯著（t=79.871,P=0.000）。小劑量紅花組、大劑量紅花組MDA含量和缺血/再灌注模型組與假手術組相比較有顯著減少（P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組MDA含量減少更顯著（t=-1.314,P=0.000）。見表2。

表2 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的超氧化物歧化酶和丙二醛的影響(x±s，n=10)

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激是腦缺血/再灌注損傷的機制之一，腦缺血/再灌注損傷后激活大量的酶性物質(zhì)引發(fā)一系列信號級聯(lián)反應,產(chǎn)生大量氧自由基，導致一系列病理生理改變。抗氧化物質(zhì)不斷清除體內(nèi)過多的氧自由基,以保持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境自由基的動態(tài)平衡，不發(fā)生自由基連鎖反應和組織損傷[5]。腦缺血后，啟動氧化應激機制，使得體內(nèi)SOD消耗過多，MDA生成增加，動態(tài)平衡打破，導致神經(jīng)細胞變性壞死進一步加重。氧化應激機制可能通過以下途徑：（1）氧自由基激活炎性因子：如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1（IL-1）等大量釋放，致使小膠質(zhì)細胞被激活產(chǎn)生大量的炎癥反應；（2）進一步損害細胞蛋白質(zhì)、糖和脂肪酸等導致細胞變性壞死；（3）氧自由基還可損傷腦細胞的DNA,進而和其他機制共同作用最終導致細胞凋亡；（4）加速體內(nèi)三羧酸循環(huán)代謝，更進一步增加了氧自由基的產(chǎn)生，造成細胞內(nèi)游離Ca2+增加,鈣離子超載的作用進一步增加,致上述惡性循環(huán)反復進行而加重腦損傷。

近年來的研究表明，紅花注射液目前被人們所廣泛認可并主要用于治療冠心病、心絞痛、脈管炎等多種血液循環(huán)障礙疾病的治療[6]。紅花注射液具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、降脂、抗炎等作用，對血栓形成有一定抑制作用[7]，還可以能明顯減輕由腦卒中引起的腦水腫[8]，改善血管阻力、擴張血管、增加腦部血流量、改善及增加纖維蛋白溶酶的活性、加強血栓溶解等，對血小板凝集有抑制作用，對缺氧缺血組織具有保護作用，紅花注射液具有減輕腦梗死患者的神經(jīng)損傷[9-10]及改善血液動力學的作用[11]。本研究結果顯示，Longa評分越高，神經(jīng)功能損害越嚴重，所以缺血/再灌注模型組評分最高，神經(jīng)功能受損最嚴重；予以紅花注射液后，評分下降明顯，神經(jīng)功能損害顯著改善，尤其以大劑量紅花組更為明顯。紅花注射液組腦梗死體積較缺血/再灌注模型組明顯縮小，而紅花注射液中以大劑量組梗死體積縮小更明顯，提示紅花注射液在一定劑量的范圍內(nèi)，劑量越大，神經(jīng)功能損害及梗死體積縮小越明顯。

HE染色顯示，缺血/再灌注模型組的神經(jīng)細胞損害最嚴重，細胞凋亡最明顯，細胞核變性壞死最嚴重，相比予以紅花注射液腹腔注射后，神經(jīng)細胞得到一定程度的改善，細胞凋亡減少，細胞形態(tài)部分正常；而大劑量紅花注射液組提示細胞形態(tài)、細胞數(shù)及核仁明顯改善。結果表明，紅花注射液具有保護作用，與以往結果相一致[12]。

本研究結果顯示，與假手術組比較，缺血/再灌注模型組的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增高，提示氧化應激參與了腦缺血/再灌注損傷的病理生理過程，2h再灌注后24h后取血再檢查，小劑量紅花組及大劑量紅花組SOD活性與缺血再灌注模型組和假手術組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中大劑量紅花組比小劑量紅花組SOD活性增高值高，提示紅花注射液能提高大鼠腦缺血血液中SOD活性。

綜上所述，紅花注射液對大鼠腦缺血/再灌注后，可以改善神經(jīng)功能評分,改善缺血區(qū)域的供血，減少腦梗死體積方面差異均有統(tǒng)計學意義,使得缺血/再灌注后細胞學形態(tài)得到明顯改善，神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯增加，提高缺血區(qū)SOD活性和減少MDA含量，尤以提高SOD的含量顯著,表明紅花注射液具有較強的抗自由基作用，從而對缺血/再灌注起到保護作用。

[1] 田京偉，傅風華，蔣王林，等.羥基紅花黃色素A對腦缺血所致大鼠腦線粒體損傷的保護作用[J].藥學學報，2004，39(10)：774.

［2］ 中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見[S]. 2006-09-30.

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[5] Suzuki J．Chemiluminescence in hypoxic brain[J]．Stroke，1988，19：65.

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[12] 歐芹，魏曉東，孫鵬，等.紅花黃色素對衰老模型小鼠腦細胞凋亡的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志，2006，21（6）：504.

Objective To investigate the effect of safflor injection on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury. Methods 40 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, ischemia reperfusion model group, low dose group, large dose of safflor group, 10 rats in each group. The contents of SOD activity and MDA were measured by 24h assay, and the HE staining was performed after reperfusion 24h. Results The activity of SOD was significantly enhanced in the small dose group and large dose group (P＜0.05), and the SOD activity was significantly higher in the large dose group (t=79.871，P=0.000 ), and the MDA in the low dose group and the sham operation group (t=-1.314，P=0.000). Conclusion The effect of safflor injection on the SOD activity and the protective effect of MDA in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury was reduced.

Middle cerebral artery occlusion；Safflor injection;Superoxide dismutase；Malondialdehyde

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.003

湖南 421001 南華大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（ 廖梓亙） 廣東510288 廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院南院急診科（ 陳慧）