倫俊杰 孫建業(yè) 殷好治 余南榮 滕祖棟

乳腺癌組織IL-17A與VEGF表達及微血管密度臨床意義研究

倫俊杰 孫建業(yè) 殷好治 余南榮 滕祖棟

目的 探討白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與VEGF、微血管密度的相關(guān)性。方法 采用免疫組化法檢測70例乳腺癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中IL-17A、VEGF蛋白和CD34標記微血管密度表達情況。結(jié)果 乳腺癌組織中IL-17A、VEGF、CD34陽性率分別為78.6%(55/70)、68.6%（48/70）和64.2%（45/70），顯著高于癌旁正常乳腺組織24.3%（17/70）、30.0%(21/70)和31.4%（22/70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者IL-17A陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P=0.005），Ⅲ+Ⅳ期患者IL-17A陽性率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P=0.018）。IL-17A表達與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、血管神經(jīng)淋巴管侵犯、PR及ER水平無關(guān)。IL-17A與VEGF、CD34在乳腺癌中的表達呈正相關(guān)（r=0.688，P=0.0032；r=0.724，P=0.0015）。乳腺癌組織中IL-17A陽性表達組MVD顯著高于陰性表達組（P=0.000）。結(jié)論 乳腺癌組織中IL-17A、VEGF、CD34高表達，IL-17A高表達可能通過促進VEGF，進而促進血管生成促進腫瘤進展，IL-17A可望成為乳腺癌抗血管治療的新靶點。

乳腺腫瘤；白細胞介素-17A；VEGF；微血管密度

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。輔助性T細胞-17（Helper T cells 17，Th17）細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與Th1、Th2及Treg細胞不同的新型效應(yīng)CD4+T細胞，白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是Th17細胞分泌的主要細胞因子之一[1]，IL-17A促進腫瘤血管生成，IL-17A促進了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2-3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在乳腺癌細胞中的表達和促血管新生的活性已經(jīng)被證實[4]。本文通過檢測IL-17A、VEGF、CD34在乳腺癌組織中的表達，分析三者的關(guān)系及在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集昌樂縣人民醫(yī)院2011年1月～2013年6月行手術(shù)切除的乳腺癌病理臘塊70份?；颊呔鶠榕?。年齡31～72歲，中位年齡51歲。均經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)前均未行其它治療。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌55例，浸潤性微乳頭狀癌8例，浸潤性小葉癌7例。組織學(xué)分級：高分化28例，中分化34例，低分化8例。按照美國癌癥聯(lián)合委員會2010年乳腺癌TNM分期標準：Ⅰ期10例，Ⅱ期34例，Ⅲ期24例，Ⅳ期2例。另以距腫瘤組織＞3cm的癌旁乳腺組織70例作對照，經(jīng)病理學(xué)確診為正常乳腺組織。均為女性，年齡31～70歲，中位年齡50歲。

1.2 主要試劑 鼠抗人IL-17A單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人血管內(nèi)皮生長因子、CD34單克隆抗體、PV-6000及DAB免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.4 免疫組化染色 采用免疫組化二步法檢測標本，操作按PV-6000試劑盒說明書進行，石蠟標本5μm厚連續(xù)切片，組織切片常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2去離子水孵育15min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗，分別滴加鼠抗人IL-17A單克隆抗體、兔抗人血管內(nèi)皮生長因子、CD34單克隆抗體，室溫過夜，PBS緩沖液沖洗，2min×3次，滴加抗體，室溫孵育20min，PBS緩沖液沖洗，2min×3次，經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水，中性樹膠封片后編號，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.5 結(jié)果判定標準 免疫組化的陽性細胞計數(shù)采用雙盲法，兩位病理醫(yī)師獨立觀察每張病理切片后作出判斷，并一起得出結(jié)論。選擇10個高倍鏡(×400)視野，每個視野計數(shù)20個細胞，根據(jù)細胞染色百分比進行評分。每張切片IL-17A、VEGF免疫組化染色總分為細胞染色強度+染色細胞陽性率。細胞染色強度：細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。細胞染色陽性率：陰性為0分，＜25%為1分，26%～50%為2分，50%～75%為3分，76%～100%為4分。最后得分0～2陰性，大于3分為陽性表達。采用免疫組化法檢測CD34標記的腫瘤血管，計數(shù)MVD值。微血管密度計數(shù)，首先在100倍鏡下選擇CD34染色較為集中的部位，然后調(diào)節(jié)到400倍顯微鏡視野下進行微血管計數(shù)。計數(shù)原則為：任何被CD34抗體染成棕黃色的孤立的內(nèi)皮細胞可作為一個計數(shù)單位；單個內(nèi)皮細胞簇團，作為1個計數(shù)單位。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組間陽性率的比較采用χ2檢驗，組間比較用Student’s t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A、VEGF和CD34的表達 乳腺癌組織中可見IL-17A高表達。IL-17A在乳腺癌組織中陽性率為78.6%(55/70)，顯著高于癌旁正常乳腺組織24.3%（17/70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=41.3，P=0.000）。VEGF在乳腺癌組織中陽性表達為68.6%（48/70），正常乳腺組織為30.0%（21/70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.1，P=0.00）。CD34乳腺癌組織中陽性表達率為64.2%（45/70），正常乳腺組織中有22例（31.4%）為陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.1，P=0.000）。

2.2 IL-17A與病理特征的關(guān)系 IL-17A在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中陽性率88.9%(40/45)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者IL-17A陽性率60%(15/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005），Ⅰ+Ⅱ期患者IL-17A陽性率68.18%(30/44)，Ⅲ+Ⅳ患者IL-17A陽性率96.15%(25/26)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014）。IL-17A的表達與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)分級，是否血管神經(jīng)淋巴管侵犯，ER、PR表達情況無關(guān)。見表1。

表1 IL-17A在乳腺癌組織中的表達及臨床因素關(guān)系（n）

2.3 IL-17A的表達與VEGF及MVD的關(guān)系 70例乳腺癌組織中IL-17A、VEGF及MVD表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.61，P=0.16）。70例乳腺癌組織同時表達IL-17A、VEGF及MVD共42例（60.0%）。Spearman等級相關(guān)分析顯示，乳腺癌組織中IL-17A的表達與VEGF表達呈正相關(guān)（r=0.688，P=0.0032）；IL-17A與CD34的表達呈正相關(guān)（r=0.724，P=0.0015）。IL-17A陽性表達組MVD值為(81.7±10.9)，顯著高于IL-17A陰性表達組(48.1±9.2)（P=0.000）。

3 討論

輔助性T細胞17（Helper T cells 17，Th17）是以高分泌白介素（interleukin,IL）17為特征的CD4+T細胞，其家族成員包括IL-17A、IL-17B、IL-C、IL-17D、IL-17E、IL-17F六個亞型[1]，IL-17A作為Th17細胞分泌的主要細胞因子，在腫瘤的生長與分化方面起了重要的作用，在結(jié)腸癌小鼠模型中，IL-17A基因缺失的小鼠腫瘤數(shù)目（1.43 vs 5.80，P=0.02）及腫瘤大?。?.17 vs 3.58mm，P=0.01）均減少，腫瘤細胞增殖指數(shù)降低[5]。IL-17在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、多發(fā)骨髓瘤等多種惡性腫瘤中表達增強[6-10]，促進了腫瘤進展。Lihong Wang等的研究表明，中國漢族女性IL-17A單核苷酸基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病相關(guān)[3]。Yang L等[11]研究表明在乳腺癌組織中TH17細胞的表達水平較正常組織有統(tǒng)計學(xué)意義，血液中Th17細胞水平與TNM分期，微血管密度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，另有研究發(fā)現(xiàn)[12]，進展期乳腺癌組織中，IL-17A的表達增加進展期乳腺癌的侵襲性，IL-17A表達與患者的愈后成負相關(guān)。通過免疫組化方法研究乳腺癌組織微環(huán)境中TH17細胞浸潤情況與臨床病理關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TH17細胞與腫瘤組織中ER/PR，分子類型成負相關(guān)，與臨床分期，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HER2表達、組織學(xué)類型無相關(guān)關(guān)系，腫瘤微環(huán)境中TH17細胞增多患者的DFS明顯低于TH17細胞減少的患者(P＜0.01)，多因素分析顯示TH17細胞水平與患者DFS負相關(guān)[(HR)2.24;95%CI 1.06～4.75][13]。本組研究結(jié)果顯示，乳腺癌細胞中IL-17A表達顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，IL-17A在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.01），Ⅰ+Ⅱ期患者陽性率顯著高于Ⅲ+Ⅳ患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014），IL-17A表達與年齡、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)分級，是否血管神經(jīng)淋巴管侵犯，ER、PR表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步證實了IL-17A可促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展，可能與患者的預(yù)后有關(guān)。

IL-17可以刺激腫瘤微環(huán)境中的成纖維細胞，上調(diào)VEGF等多種血管形成因子的表達，刺激血管內(nèi)皮細胞遷移促進血管生成。Wang M等[14]研究表明IL-17A/IL-17RA相互作用，促進小鼠骨肉瘤細胞分泌VEGF，MMP9和CXCR4，從而增加小鼠骨肉瘤轉(zhuǎn)移機會。Hayata K[15]等利用siRNA腺病毒載體瘤內(nèi)注射抑制IL-17A表達可顯著抑制腫瘤組織中的CD31、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和VEGF表達。乳腺癌小鼠模型中荷瘤小鼠微血管密度與IL-17在組織中的表達及血清水平成正比[16]。臨床研究中多發(fā)骨髓瘤患者血清中VEGF和IL-17的水平較正常對照組明顯增加，并且IL-17與VEGF呈正相關(guān)，VEGF可能刺激IL-17分泌，IL-17也可刺激VEGF分泌[10]。動物實驗中輸注IL-17A的肝癌組織有更高的微血管密度[9]。乳腺癌中TH17細胞可通過上調(diào)VEGF的表達刺激血管內(nèi)皮細胞的遷移與聚集，促進腫瘤血管生成[11]。本研究結(jié)果表明，IL-17A、VEGF在乳腺癌中的表達顯著高于癌旁正常組織，并且IL-17A與VEGF、微血管密度表達均呈正相關(guān)。IL-17A陽性表達組MVD顯著高于IL-17A陰性表達組（P=0.000）。因此，IL-17A可能通過促進VEGF表達促進血管生存，最終促進腫瘤進展。Chung AS等[17]的研究顯示，IL-17通過輔助性T細胞信號傳遞作用降低了小鼠模型中VEGF抑制型藥物的活性，導(dǎo)致腫瘤抗血管治療失效。因此，抑制IL-17的作用，可能提高VEGF靶向藥物的臨床療效[17]。

綜上所述，IL-17A的表達可能在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，乳腺癌中IL-17A高表達可能是通過促進VEGF表達增加血管密度，加速了腫瘤進展。

[1] Wilke CM,Bishop K,Fox D,et al.Deciphering the role of TH17 cells in human disease [J].Trends Immunol,2011,32(12)：603-611.

[2] Huang CK，Yang CY,Jeng YM,et al.Autocrine/paracrine mechanism of interleukin-17B receptor promotes breast aumorigenesis through NF-kappaB-mediated antiapoptotic pathway[J]. oncogene,2014,33(23)：2968-2977.

[3] Lihong Wang1,Yongdong Jiang,Youxue Zhang,et al.Association Analysis of IL-17A and IL-17F Polymorphisms in Chinese Han Women with Breast Cancer[J].PLoS ONE,2013,7(3)：e34400.

[4] 陳駿，于亮，段紹斌.等.血管內(nèi)皮生長因子-C mRNA和微血管密度與乳腺癌預(yù)后相關(guān)性關(guān)系的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2009, 16(24)：1928-1931.

[5] Yil Sik Hyun,Dong Soo Han,AReum Lee,et al.Role of IL-17A in the development of colitis-associated cancer[J].Carcinogenesis 2012,33(4)：931-936.

[6] Li Q,Han Y,Fei G,et al.IL-17 promoted metastasis of non-small-cell lung cancer cells[J].Immunol Lett,2012,148(2)：144-150.

[7] Wu X,Zeng Z,Chen B,et al.Association between polymorphisms in interleukin-17A and interleukin-17F genes and risks of gastric cancer[J].Int J Cancer,2010,127(1)：86-92.

[8] 彭波,李華,王育斌.等.結(jié)直腸癌患者癌組織中IL-17A和IL-17F的表達及意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,3(3)：388-390.

[9] 張玄，鄭翔，何凡,等.原發(fā)性肝癌中白細胞介素-17A的表達及其臨床意義[J].中華肝膽外科雜志，2013,19(2)：143-146.

[10] 董沙沙，李廣倫，楊頡.多發(fā)性骨髓瘤患者血清血管內(nèi)皮生長因子和白介素-17水平變化的臨床意義[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2012，20(2)：344-347.

[11] Yang L,Qi Y,Hu J,et al.Expression of Th17 cells in breast cancer tissue and its association with clinical parameters[J].Cell Biochem Biophys，2012,62(1)：153-159.

[12] Benevides L,Cardoso CR,Tiezzi DG,et al.Enrichment of regulatory T cells in invasive breast tumor correlates with the upregulation of IL-17A expression and invasiveness of the tumor[J].Eur J Immunol，2013,43(6)：1518-1528.

[13] Chen WC,Lai YH,Chen HY,et al.Interleukin-17-producing cell infiltration in the breast cancer tumour microenvironment is a poor prognostic factor[J].Histopathology，2013,63(2)：225-233.

[14] Wang M,Wang L,Ren T,et al.IL-17A/IL-17RA interaction promoted metastasis of osteosarcoma cells[J].Cancer Biol Ther，2013,14(2)：155-163.

[15] Hayata K，Iwahashi M，Ojima T,et al.Inhibition of IL-17A in tumor microenvironment augments cytotoxicity of tumor-infiltrating lymphocytes in tumor-bearing mice[J].PLoS One，2013,8(1)：e53131.

[16] Du JW,Xu KY,Fang LY,et al.Interleukin-17,produced by lymphocytes,promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of breast cancer[J].Molecular medicine reports,2012,6(5)：1099-1102.

[17] Chung AS，Wu X，Zhuang G,et al.An interleukin-17-mediated paracrine network promotes tumor resistance to anti-angiogenic therapy[J].Nat Med，2013,19(9)：1114-1123.

Objective To investigate the expression of interleukin-17A（IL-17A） in breast cancer and to find out the relationship between the expression of IL-17A,VEGF and microvessel density. Methods The immunohistochemical method was used to detect the expressions of IL-17A，VEGF protein and the microvessel density of CD34 markers in 70 cases of breast cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues, and their relationship with clinicopathological features were analyzed. Results The positive expression rate of IL-17A、VEGF and CD34 in breast cancer tissues was 78.6% (55/70)，68.6%（48/70）and 64.2%（45/70）, significantly higher than that in adjacent normal tissues of 24.3%（17/70），30.0% (21/70) and 31.4%（22/70）. The positive rate of IL-17A in cases with lymph node metastasis was significantly higher than that without lymph node metastasis（P=0.005）. The positive rate of IL-17A in Ⅲ+Ⅳ stages was significantly higher than that in Ⅰ+Ⅱstages（P=0.018）. There were no relationship between the expression of IL-17A and age, tumor diameter, histological grading, vascular nerve lymphatic invasion, PR and ER level. The expression intensity of IL-17A was positively correlated with VEGF and CD34 in breast cancer tissues（r=0.688, P=0.0032；r=0.724, P=0.0015）. MVD in positive expression of IL-17A group was higher than that in negative group（P=0.000）. Conclution The expression of IL-17A，VEGF，CD34 are high in breast cancer, IL-17A might affect breast cancer by promote VEGF expression in angiogenesis, IL-17A is expected to become a new target for anti-angiogenic therapy in breast cancer.

Breast neoplasms; IL-17A; Vascular endotheliel growet factor; Micro vessel density

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.002

山東 262400 山東昌樂縣人民醫(yī)院腫瘤科 （倫俊杰 孫建業(yè) 殷好治 滕祖棟） 廣東 510095 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科 （余南榮）

殷好治 E-mail：sdyhz@163.com