鄭玉紅　張智　陸波等

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記，對彩色馬蹄蓮Parfait（Pr）及其秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體（Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異進(jìn)行研究。從40個寡聚核苷酸引物種篩選出14個合適的引物進(jìn)行擴(kuò)增，5個樣品共擴(kuò)增出位點90個，平均每個引物擴(kuò)增出6.29個位點；其中，多態(tài)性位點39個，多態(tài)性位點的比率為43.33%。此外，還觀察到的等位基因數(shù)（na）為1.4021個，有效等位基因數(shù)（ne）為1.2965個，Neis基因多樣性（h）為0.166 6，Shannons多樣性指數(shù)（I）為0.242 1。可見，多倍體誘導(dǎo)和輻射誘變使彩色馬蹄蓮Parfait在分子水平產(chǎn)生了一定的變異，豐富了彩色馬蹄蓮遺傳多樣性。通過聚類分析將5個樣品可分為2支，其中Pr、Pr-2和Pr-d聚為一支，Pr-1和Pr-4聚為一支。

關(guān)鍵詞：多倍體；誘導(dǎo)；彩色馬蹄蓮；RAPD；遺傳相似性；聚類分析；抗病育種；分子生物學(xué)

中圖分類號： S335.21；S682.2+64.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0142-02

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本植物，原產(chǎn)于南非[1]。自20世紀(jì)80年代末引入我國以來，彩色馬蹄蓮以其花色絢爛、花形高雅、觀花期長而深受消費(fèi)者的喜愛，因此被稱為21世紀(jì)的“明星花卉”。彩色馬蹄蓮在栽培過程中最嚴(yán)重的病害是軟腐病[2]，其在引種到我國長江中下游地區(qū)后受高溫高濕的影響，軟腐病病害問題更加突出，培育抗軟腐病的彩色馬蹄蓮品種是解決這一問題的有效途徑。但彩色馬蹄蓮所有品種對該病的抗性均比較弱；而且目前彩色馬蹄蓮新品種培育方式以雜交育種為主。很顯然，這種育種方式很難培育出抗病的彩色馬蹄蓮品種。所以，研究人員探索采用物理或化學(xué)誘變的方式提高彩色馬蹄蓮的抗病性，從而培育抗病的彩色馬蹄蓮品種。本試驗采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對彩色馬蹄蓮品種Parfait（編號為Pr）及其秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體（編號為Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（分別編號為Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異和差異進(jìn)行研究，為彩色馬蹄蓮抗病新品種的培育提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為2002年引種自荷蘭的彩色馬蹄蓮品種Parfait，其佛焰苞粉紅色（上紅下白），葉片盾劍形，上有斑點，引種后在本地的適應(yīng)性良好。除Parfait外，還有經(jīng)20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射處理的Parfait組培苗及秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體Parfait組培苗共5個樣品，每個樣品組培苗繼代次數(shù)均在10次以上，隨機(jī)選取10株，每株分別取樣，然后混合，用于提取DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 模板DNA的制備與檢測

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司出品的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取彩色馬蹄蓮葉片DNA；采用貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的DU800紫外/可見光分光光度計測定DNA純度和含量，并對濃度較高的樣品進(jìn)行稀釋，-20 ℃儲存，備用。

1.2.2 RAPD-PCR 體系及引物篩選

以提取的彩色馬蹄蓮Parfait DNA為模板，參照陸波等的方法[3]，對北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40條引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇條帶多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增位點多的引物對供試的彩色馬蹄蓮品種及Parfait輻射誘變處理和多倍體進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品的擴(kuò)增條帶按有（記為1）、無（記為0）進(jìn)行記錄，在Excel表格上生成數(shù)據(jù)矩陣。計算擴(kuò)增條帶的多態(tài)率，用POPGen32軟件[4]進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩色馬蹄蓮樣品RAPD分子標(biāo)記結(jié)果

利用篩選出來的引物，對彩色馬蹄蓮 Parfait、Parfait四倍體和輻射誘變后代進(jìn)行RAPD-PCR，最終篩選出具有特異性條帶的引物14個，共獲得90個位點，平均每個引物擴(kuò)增出6.43個位點；其中，多態(tài)性位點39個，多態(tài)性位點比例為4333%。引物RAPD-47和RAPD-66擴(kuò)增出的位點最多，均為9個；RAPD-73擴(kuò)增出的位點最少，僅4個。引物RAPD-66擴(kuò)增出的多態(tài)位點比例最高，為88.89%；有半數(shù)引物擴(kuò)增出的位點全部為共有位點，多態(tài)性位點比例為0（表1）。由引物66擴(kuò)增的RAPD圖譜（圖1）可見，多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射使Parfait擴(kuò)增片段減少，從而表現(xiàn)出多態(tài)性。

2.2 彩色馬蹄蓮Parfait 四倍體及其輻射誘變后代分子水平變異分析

5個陳彩色馬蹄蓮樣品觀察到的等位基因數(shù)（na）為1402 1個，有效等位基因數(shù)（ne）為1.296 5個，Neis基因多樣性（h）為0.1666，Shannons多樣性指數(shù)（I）為0.242 1。

2.3 彩色馬蹄蓮Parfait多倍體及其輻射誘變與其他品種的親緣關(guān)系的聚類分析

由表2可知，40 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-2）與四倍體Parfait（Pr-D）遺傳相似系數(shù)最大，為0.886 6；Parfait與其60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-4）間遺傳相似系數(shù)最小，為0.701 0；所有樣品遺傳相似系數(shù)的平均值0.791 8。

由圖2可以看出，5個樣品可分為2類，Pr、Pr-2和 Pr-D 聚為一支；Pr-2和Pr-4聚為一支。

3 結(jié)論與討論

自20世紀(jì)80年代以來，我國共引入彩色馬蹄蓮品種40多個。此后，我國研究人員對彩色馬蹄蓮的快繁技術(shù)[5-6]、栽培措施[7-9]、花期調(diào)控[10-12]和抗病生理[13-14]等進(jìn)行了廣泛的研究，但關(guān)于彩色馬蹄蓮的分子生物學(xué)方面的研究僅有零星的報道[15-17]。在彩色馬蹄蓮品種間的親緣關(guān)系和多樣性分析方面，迄今只有張永春等利用ISSR對10個彩色馬蹄蓮品種進(jìn)行鑒定[17]。本試驗利用RAPD技術(shù)研究多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射對彩色馬蹄蓮品種Parfait分子水平遺傳變異的影響，結(jié)果表明，Parfait、Parfait四倍體及其 60Co γ射線輻射處理多態(tài)性條帶比率最高為88.89%，平均值為 43.33%，多態(tài)性主要表現(xiàn)為多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射使Parfait的擴(kuò)增片段減少，但這種多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于彩色馬蹄蓮品種間多態(tài)性[17]；但與陳臻等基于ISSR標(biāo)記 12C6+重離子輻射下的彩色馬蹄蓮多態(tài)性十分接近[18]。各樣品間的遺傳相似系數(shù)最大為0.886 6，低于彩色馬蹄蓮品種間的遺傳相似系數(shù)[17]，說明多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射處理致使Parfait分子水平的變異已經(jīng)達(dá)到了品種水平。在對其變異性狀及其穩(wěn)定性進(jìn)行觀測的基礎(chǔ)上，培育出彩色馬蹄蓮新品種是完全可能的。同時，各樣品多態(tài)性條帶比率最高達(dá)88.89%，表明通過建立彩色馬蹄蓮品種分子指紋圖譜鑒別彩色馬蹄蓮品種以解決市場上彩色馬蹄蓮品種混亂的問題是可行的。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國植物志編輯委員會. 中國植物志：第13卷第2分冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990.

[2]谷春艷，范加勤，楊 雪，等. 彩色馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病菌的鑒定及其群體感應(yīng)淬滅的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，32（3）：71-77.

[3]陸 波，鄭玉紅，彭 峰，等. 均勻設(shè)計法優(yōu)化彩色馬蹄蓮品種的RAPD-PCR反應(yīng)體系[J]. 北方園藝，2012（11）：123-126.

[4]Yeh F C，Yang R C，Boyle T. POPGENE version 1.31：microsoft window-based freeware for population genetic analysis[CP /CD]. Edmonton：University of Alberta，1999.

[5]林 榮，王秀琴. 馬蹄蓮的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 廣西植物，1989，9（2）：97-102.

[6]范加勤，張雯雯，張 娜，等. 幾個彩色馬蹄蓮品種的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28（2）：28-31.

[7]張軍云，楊向紅，李 恒，等. 彩色馬蹄蓮試管苗移載育苗技術(shù)研究[J]. 北方園藝，2009（4）：202-204.

[8]徐 瓊，彭志云. 栽培基質(zhì)對彩色馬蹄蓮試管移栽成苗及成球效果的研究[J]. 農(nóng)業(yè)網(wǎng)絡(luò)信息，2007（5）：215-216，229.

[9]彭 峰，陳嫣嫣，郝日明，等. 彩色馬蹄蓮組培苗壯苗生根及移栽措施研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：126-128.

[10]黃作喜，吳學(xué)尉，段輝國，等. 彩色馬蹄蓮種球采收處理技術(shù)[J]. 內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報，2004，19（2）：35-37.

[11]錢妙芬. 馬蹄蓮花期調(diào)控指標(biāo)探析[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，11（4）：32-33.

[12]張璐萍，唐開學(xué)，張麗芳. 溫度、赤霉素、光照對彩色馬蹄蓮的花期調(diào)控[J]. 種子，2005，24（10）：36-37.

[13]徐 瓊，彭志云，徐秉良，等. 栽培措施對彩色馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病發(fā)生的影響[J]. 植物保護(hù)，2008，34（2）：87-89.

[14]王 敏，姬廣海，修建華，等. 云南省馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病原鑒定[J]. 西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，29（8）：79-82.

[15]楊柳燕，張永春，湯庚國，等. 彩色馬蹄蓮 mRNA差異顯示技術(shù)體系的建立[J]. 分子植物育種，2012，11（1）：267-272.

[16]劉懷阿，蘇建坤，劉 琴，等.白花馬蹄蓮誘導(dǎo)胡蘿卜軟腐果膠桿菌ubiG基因的克隆與功能分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（6）：1304-1312.

[17]張永春，湯庚國，褚云霞，等. 彩色馬蹄蓮ISSR體系的建立及初步分析[J]. 分子植物育種，2009，7（4）：827-832.

[18]陳 臻，徐秉良，蒲崇建，等. 12C6+重離子輻射下彩色馬蹄蓮生理生化和抗病性的變化及ISSR多態(tài)性分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2013，27（5）：552-556.