宋秋艷 董瑞鴻

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450000

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧條件下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運(yùn)輸，是體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子[1]。HIF-1α在各類癌組織血管生成方面的研究是目前臨床上的熱點(diǎn)[2]，但是其與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、微血管密度（microvessel density，MVD）的關(guān)系研究在國內(nèi)還比較少見。本研究旨在探討HIF-1α在合并糖尿病乳腺癌組織中的表達(dá)及其與VEGF和MVD，來研究HIF-1α在乳腺癌組織生長、癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年6月～2015年6月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的乳腺癌合并2型糖尿病的女性患者的乳腺標(biāo)本蠟塊79例（觀察組）和非糖尿病的乳腺癌患者乳腺標(biāo)本蠟塊95例（對照組）。兩組患者均為女性，觀察組年齡28～71歲，平均（48.5±9.2）歲，對照組年齡 31～74 歲，平均（47.1±8.8）歲。兩組患者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者在術(shù)前均未接受過放化療的治療，全部病例類型均為浸潤癌?；颊弑幻黠@確認(rèn)為乳腺癌患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)：通過影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)檢查，并經(jīng)過兩名權(quán)威乳腺癌診治專家進(jìn)行鑒別得到確診的乳腺癌患者[3]。

1.2 試劑與儀器

HIF-1α單抗?jié)饪s液、VEGF單抗?jié)饪s液均購自武漢博士德生物科技有限公司；CD34單抗工作液、SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色劑、HE染色劑均購自福州邁新生物科技有限公司。

1.3 檢測方法

乳腺癌患者石蠟包埋標(biāo)本共174例，每例蠟塊間斷連續(xù)切取4 μm切片5張，選取1張進(jìn)行常規(guī)的HE染色，其他切片進(jìn)行HIF-1α、VEGF、MVD免疫組化染色。免疫組化染色采用SP法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：①烤片，68℃，20 min。②常規(guī)二甲苯脫蠟（二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min），梯度酒精脫水（100%乙醇Ⅰ10 min，100%乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min。③阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min。④抗原修復(fù)：置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中用煮沸（95℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min。⑤正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗。⑥滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。⑦滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育 30 min，PBS 沖洗 3×5 min。⑧DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片[4-5]。

1.4 結(jié)果判定

以武漢博士德生物科技有限公司和福州邁新生物科技有限公司提供的陽性切片為標(biāo)準(zhǔn)，在高倍光鏡下HIF-1α以細(xì)胞核或核漿內(nèi)有棕黃色顆?；虮蝗旧勺攸S色為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[6]。高倍鏡下（400）每張切片隨機(jī)選取5個視野，每個視野計(jì)數(shù)150個細(xì)胞，共計(jì)750個，計(jì)算陽性細(xì)胞率，≤15%為陰性，＞15%為陽性。VEGF以細(xì)胞核或核漿內(nèi)呈棕黃色為陽性細(xì)胞，＞10%為陽性，≤10%為陰性。MVD：低倍光鏡下選取血管分布最為密集的區(qū)域，400倍光鏡視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個視野，CD34呈棕黃色為陽性，計(jì)數(shù)5個視野中的血管數(shù)的平均值構(gòu)成MVD，要排除有炎癥、肉芽或壞死的血管[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析研究各指標(biāo)間的關(guān)系；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組臨床病理特征的對比

通過數(shù)據(jù)分析，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，觀察組的轉(zhuǎn)移率為65.8%（52/79），對照組的轉(zhuǎn)移率為35.8%（34/95），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在年齡、月經(jīng)情況和雌、孕激素受體狀況方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表 1。

2.2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)

通過視鏡的觀察，HIF-1α的表達(dá)主要體現(xiàn)在浸潤腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，觀察組陽性表達(dá)率高于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；觀察組VEGF的陽性表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)均高于對照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組患者臨床病理特征分析

表2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)

2.3 乳腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)及其與 VEGF、微血管密度MVD的關(guān)系

觀察組HIF-1α陽性表達(dá)的71例組織中，65例VEGF陽性表達(dá)；HIF-1α陰性表達(dá)的8例組織中，6例VEGF陽性表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對照組HIF-1α陽性表達(dá)的69例組織中，56例VEGF陽性表達(dá)；HIF-1α陰性表達(dá)的26例組織中，21例VEGF陽性表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。觀察組組織中HIF-1α陽性者的MVD計(jì)數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與VEGF及MVD均呈正相關(guān)（r=0.695，P ＜ 0.01；r=0.680，P ＜ 0.05）。

表3 乳腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)與VEGF的相關(guān)性[n（%）]

表4 兩組患者不同HIF-1α表達(dá)情況MVD計(jì)數(shù)比較（）

表4 兩組患者不同HIF-1α表達(dá)情況MVD計(jì)數(shù)比較（）

注：HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α；MVD：微血管密度

組別 例數(shù) HIF-1α陽性HIF-1α陰性 t值 P值觀察組對照組79 95 121.2±31.8 111.4±31.6 102.5±33.2 103.5±27.3 2.204 1.202 0.030 0.232

3 討論

既往的研究表明，合并糖尿病的乳腺癌患者的乳腺癌的分化程度比較低，預(yù)后也比較差[8-10]。在本研究中，HIF-1α和VEGF的陽性表達(dá)主要存在于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)或是細(xì)胞核漿內(nèi)，在浸潤癌細(xì)胞邊緣的表達(dá)相對較弱，這可以作為乳腺癌早期浸潤階段的生物學(xué)指標(biāo)，提示不良的預(yù)后[11]。

血管的成長在各種組織的修復(fù)或惡化，炎癥和腫瘤的加重或增生、轉(zhuǎn)移過程中都有比較重要的作用[12-14]。特別是合并糖尿病、高血壓等并發(fā)癥的腫瘤患者的癌變組織需要通過新生的微血管來補(bǔ)充必要的養(yǎng)分來維持正常的生理代謝，為進(jìn)一步的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移提供動力。在國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究表明，HIF-1α和VEGF是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新血管的主要細(xì)胞因子，且HIF-1α的陽性表達(dá)是通過VEGF的陽性表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，可見VEGF在腫瘤新血管生成方面的作用比較強(qiáng)[15-17]。HIF-1α是在缺氧條件下存在于人體內(nèi)的一種異源二聚體，既是氧調(diào)節(jié)亞基也是一種活性基，它可以和VEGF的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，促進(jìn)癌變組織的新血管形成，維持癌細(xì)胞的正常代謝功能并能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18-20]。在本研究中，通過數(shù)據(jù)的對比分析發(fā)現(xiàn)，合并2型糖尿病的乳腺癌患者HIF-1α的陽性表達(dá)率為89.9%（71/79），對照組患者為 72.6%（69/95）。這就表明，影響合并2型糖尿病的乳腺癌患者預(yù)后的重要因子就是HIF-1α。與此同時，本研究也檢測了兩組患者乳腺癌組織中MVD數(shù)量，結(jié)果顯示觀察組的MVD數(shù)量明顯高于對照組。這些都表明合并2型糖尿病的乳腺癌患者預(yù)后較差，與HIF-1α和VEGF的表達(dá)和MVD數(shù)量有直接的關(guān)系。本研究通過Pearson相關(guān)分析顯示，HIF-1α和 VEGF呈正相關(guān)（r=0.695，P ＜ 0.01），與 MVD 也呈正相關(guān)（r=0.680，P ＜ 0.05）。

綜上所述，通過研究合并2型糖尿病的乳腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)及其與VEGF、MVD的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)合并2型糖尿病可能會影響乳腺癌患者的病情甚至造成癌變組織的增生和轉(zhuǎn)移，使預(yù)后變差。這也為糖尿病與乳腺癌之間的關(guān)系提供了有力的依據(jù)。

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