王小雪 黨 磊 張美姿 郭飛馬 龐 欣

航天神舟生物科技集團有限公司生物醫(yī)藥研究所 北京市空間生物工程技術研究中心，北京 100190

輔酶Q10具有皮膚修復功效，其在個人護理產(chǎn)品中應用逐漸增多。輔酶Q10的生理作用包括抑制線粒體氧化和激活皮膚細胞代謝，降低皮膚成纖維細胞中活性氧（ROS）水平，抑制細胞凋亡[1-3]；還可降低皮膚成纖維細胞中由于紫外線損傷造成的金屬蛋白酶水平升高，促進皮細胞增殖，增加成纖維細胞中Ⅳ和Ⅶ型膠原表達。上述文獻表明輔酶Q10其具有抗皮膚氧化、抗衰老作用。輔酶Q10還可通過抑制酪氨酸激酶活性來降低B16細胞中黑色素的生成，達到美白的效果。因此在個人護理品中添加輔酶Q10也日漸普遍，用于預防和修復皮膚光老化[4-7]。

但是輔酶Q10分子量大，在水中溶解度低，造成其生物利用度低，不易透皮吸收，這一問題限制了輔酶Q10在化妝品中的應用。已有研究將輔酶Q10制備成納米脂質載體（nanostructured lipid carriers，NLC）、固體脂質納米粒、納米微囊與極微小納米脂質載體等，增大輔酶Q10在人皮膚成纖維細胞與離體皮膚組織的吸收，但是這類制劑穩(wěn)定性較低。微乳給藥系統(tǒng)通過增加藥物溶解度來提高通透濃度梯度，增加角質層脂質雙分子層流動性等方式促進藥物經(jīng)皮吸收，可用于制備穩(wěn)定的輔酶Q10制劑[8-14]。

1 材料與儀器

1.1 材料

輔酶Q10（神舟生物科技有限公司）；輔酶Q10標準品（美國Sigma公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH-40，德國BASF公司）；單硬脂酸三聚甘油酯（TGMS）（瑞士LONZA公司）；甲醇為色譜純，乙醇為分析醇。

人胚胎成纖維（ESF）細胞、永生化上皮（Hacat）細胞購自北京協(xié)和細胞資源中心；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；ROS試劑盒（碧云天生物技術公司），人源基質金屬蛋白酶 1（MMP-1）ELISA 試劑盒（美國 R&D Systems，Inc.公司）。蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術公司）。

1.2 儀器

2996型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；RCTBasic型恒溫磁力攪拌器（德國IKA公司）；NS1001L高壓均質機（意大利Niro Soavi公司）；Mastersizer 2000型激光散射粒徑測定儀（英國Malven公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；紫外輻照源（美國Spectroline公司）；熒光分析儀（美國Thermo Scientific公司）。

2 方法

2.1 輔酶Q10微乳含量測定方法

按照《中國藥典》2010版[15]方法測定輔酶Q10微乳含量。色譜柱：waters Symmetry C18（5 μm，3.9 mm ×150 mm）；流動相（甲醇∶乙醇=50∶50）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；溫度：25℃；進樣：20 μL。取輔酶Q10 標準品溶液，按照 4、10、20、40、50 μg/mL 梯度稀釋，采用無水乙醇定容，依次進樣，根據(jù)濃度與峰面積比建立標準曲線。

精密度試驗：取同一標準品溶液，重復進樣6次，每次20 μL，按上述色譜條件測得峰面積。

2.2 輔酶Q10微乳的制備

采用聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）與TGMS作為輔酶Q10微乳的乳化劑[16]。將兩種乳化劑依照1∶1（W/W）的比例準確稱取后充分混合均勻，作為混合表面活性劑。將混合表面活性劑與輔酶Q10依照1∶1（W/W）混合后，65℃水浴，磁力攪拌滴加水相，形成5%輔酶Q10粗微乳。將粗微乳液樣品通過高壓均質機在80 MPa壓力下均質3次，制備得到輔酶Q10微乳液。

2.3 微乳理化指標評價

采用激光粒度儀測定輔酶Q10的粒徑與Zeta電位。取微乳樣品5.0 g，測定pH值。旋轉式黏度計測定微乳黏度。取微乳樣品10.0 g裝于離心管中，4000 r/min離心30 min，觀察微乳外觀性狀。

2.4 長期穩(wěn)定性

取3批輔酶Q10微乳樣品，棕色西林瓶中密封包裝，置于25℃，RH 60%的藥品穩(wěn)定性試驗箱中12個月，在第0、3、6、12個月月末分別取樣1次，觀察乳劑外觀性狀，采用“2.3”項下方法評價微乳穩(wěn)定性，測定微乳pH值，并按照“2.1”項下方法測定輔酶Q10含量。

2.5 輔酶Q10微乳體外抗紫外輻射實驗

2.5.1 細胞培養(yǎng) 具體方法參照國家實驗細胞資源平臺提供的關于ESF、Hacat細胞培養(yǎng)方法[5]。簡要步驟：分別將ESF、Hacat細胞置75mL細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10%的胎牛血清及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5.2 UVA、UVB輻射損傷細胞模型的建立 Hacat細胞和ESF細胞接種于12孔板中（1×105/孔），使用DMEM培養(yǎng)基，用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，將細胞分為空白對照組、模型組、空微乳組、輔酶Q10 微乳不同劑量 [1、5、10 μmol/L， 磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶媒]組?？瘴⑷楹洼o酶Q10不同劑量組加入藥物處理，空白對照組和模型組加入等體積溶媒，以上處理細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞用PBS清洗后，除空白對照組外，其余各組細胞放入紫外輻照箱中進行UVA（320～400 nm，峰值 365 nm）、UVB（280～320 nm，峰值312 nm）輻照損傷。UVA處理Hacat細胞輻照劑量為14 J/cm2，處理ESF細胞輻照劑量為15 J/cm2。UVB處理Hacat細胞輻照劑量為20 mJ/cm2，處理ESF細胞輻照劑量為60 mJ/cm2。紫外處理后，PBS清洗細胞，按前述分組繼續(xù)處理24 h。

2.5.3 細胞內(nèi)ROS的檢測 使用ROS檢測試劑盒進行胞內(nèi)ROS水平的檢測。熒光信號使用熒光分析儀進行，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm。同時檢測蛋白含量對結果進行校正，蛋白含量測定使用聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白濃度測定試劑盒進行檢測。

2.5.4 ESF細胞外MMP-1的檢測 采用人源MMP-1 ELISA試劑盒檢測經(jīng)UV輻射后ESF細胞培養(yǎng)基中MMP-1水平。BCA蛋白濃度測定試劑盒對總蛋白含量結果進行校正。

2.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5軟件進行處理分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示。多組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 輔酶Q10微乳含量測定方法

在該分析方法下，乳劑中的輔料對藥物的測定無干擾。該法用于檢測微乳中輔酶Q10的含量，專屬性良好。以輔酶Q10峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標進行線性回歸。得回歸方程為：A=20508 C-28861，r2=0.9997，線性范圍為 4～50 μg/mL。重復進樣，測定輔酶Q10的峰面積，計算相對標準差（RSD）為0.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1 空微乳（A）、輔酶Q10微乳（B）、輔酶Q10標準品（C）色譜圖

3.2 輔酶Q10微乳理化指標評價

用激光粒度儀測得輔酶Q10微乳的平均粒徑為（225.2±23.76）nm，測得 Zeta 電位為-（39.5±6.06）mV。實驗結果表明，pH計測得微乳pH為（6.12±0.04），使用旋轉式黏度計測定20℃下微乳黏度，結果為1.0 Pa·s，其黏度與水的黏度相近。

輔酶Q10微乳經(jīng)4000 r/min離心30 min，無分層、無沉淀；外觀性狀無明顯變化。輔酶Q10微乳在第 0、3、6、12 個月月末取樣時（n=6），外觀性狀、離心穩(wěn)定性、含量測定的結果見表1。

表1 輔酶Q10微乳液長期穩(wěn)定性考察（）

表1 輔酶Q10微乳液長期穩(wěn)定性考察（）

放置時間 外觀性狀 穩(wěn)定性考察 pH值 含量（%）0個月3個月6個月12個月橙黃色均勻水溶液橙黃色均勻水溶液橙黃色均勻水溶液橙黃色均勻水溶液無沉淀、無分層無沉淀、無分層無沉淀、無分層無沉淀、無分層6.12±0.04 6.04±0.05 5.83±0.11 5.76±0.15 5.55±0.35 4.83±0.13 4.67±0.11 4.62±0.06

3.3 輔酶Q10微乳對ESF、Hacat細胞內(nèi)ROS水平的影響

UVA、UVB輻照會對ESF、Hacat細胞造成氧化損傷，致使模型組細胞中ROS水平明顯升高（P＜0.01），該結果表明模型建立成功。各劑量（1、5、10 μmol/L）輔酶Q10微乳均能明顯降低UVA照射后的Hacat細胞中的 ROS 水平（P ＜ 0.05）；高劑量（10 μmol/L）輔酶Q10微乳能顯著降低UVA照射后的ESF細胞中的ROS 水平（P ＜ 0.01）。中高劑量（5、10 μmol/L）輔酶Q10微乳能明顯降低UVB照射后的Hacat細胞中的ROS 水平（P ＜ 0.05）；中高劑量（5、10 μmol/L）輔酶Q10微乳顯著降低UVB照射后的Hacat細胞中的ROS水平（P ＜ 0.01）。見圖 2。

圖2 輔酶Q10微乳對紫外輻射后ESF、Hacat細胞內(nèi)ROS水平影響

3.4 輔酶Q10微乳對ESF細胞MMP-1表達的影響

與空白對照組比較，模型組經(jīng)UVA、UVB照射后，細胞上清液中MMP-1含量均明顯升高（P＜0.01），該結果表明模型建立成功，紫外線對皮膚細胞具有損傷作用。與模型組比較，空微乳組對MMP-1含量沒有影響。UVA 照射后，中高劑量（5、10 μmol/L）給藥組MMP-1含量明顯降低（P＜0.05）；UVB照射后，各劑量（1、5、10 μmol/L）給藥組 MMP-1 含量顯著降低（P ＜0.01）。見圖 3。

圖3 輔酶Q10微乳對紫外輻射后ESF細胞MMP-1影響

4 討論

輔酶Q10由于分子量大，不溶于水，不易被表皮吸收[17]。有文獻采用中鏈脂肪酸辛酸癸酸三甘油酯、向日葵卵磷脂、乳化蠟作為油相，增大輔酶Q10的溶解度，制成納米顆粒、微囊、微乳等劑型[11，18-19]。但是此方法會增大表面活性劑的用量。本研究利用輔酶Q10熔點低（49℃）的特點，將制備溫度控制在60℃以上，不使用油相溶解輔酶Q10，保持輔酶Q10熔化狀態(tài)與表面活性劑混合均質，成為分布均勻的微乳液，此方法可以減少乳化劑的用量。

皮膚用微乳的制劑載體所選組分必須考慮皮膚刺激性。已有文獻采用聚氧乙烯（20）十八烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、泊洛沙姆188制備輔酶Q10微乳[19-21]。本研究選用化妝品工業(yè)中常使用的聚氧乙烯氫化蓖麻油和單硬脂酸三聚甘油酯，較其他乳化劑刺激性較弱，皮膚使用安全性較高。本研究利用上述復合乳化劑制備了輔酶Q10 O/W微乳，理化性質結果顯示，制得的輔酶Q10 O/W微乳平均粒徑為235 nm左右，平均Zeta電位為-（39.5±6.06）mV，該粒度分布可使乳劑在較長時間內(nèi)保持其物理穩(wěn)定性。乳滴表面所帶負電荷可使乳滴之間產(chǎn)生相互排斥力，從而防止乳滴相互聚集，提高其穩(wěn)定性。本研究考察了輔酶Q10微乳在25℃條件下長期放置的穩(wěn)定性，結果表明該制劑在25℃條件下可穩(wěn)定放置12個月。

長期、大劑量紫外照射后，人皮膚成纖維細胞和人上皮細胞中ROS的產(chǎn)生速度超過其被清除的速度，損傷的抗氧化防御體系會導致更多ROS的產(chǎn)生。大量損傷誘導的ROS可作為第二信使，刺激基質金屬蛋白酶基因轉錄，促進MMP-1的生成。MMP-1通過水解、破壞及重組細胞外基質，引起皮膚結締組織結構重建，導致了光老化皮膚特有的粗深皺紋生成[22]。體外活性實驗結果表明，模型組經(jīng)UV輻照后，皮膚成纖維細胞和表皮細胞的ROS、MMP-1水平明顯增高，表明UV照射可以造成培養(yǎng)皮膚成纖維細胞的損傷。各劑量輔酶Q10微乳可降低UVA、UVB照射后的皮膚成纖維細胞、表皮細胞中的ROS、MMP-1水平，中高劑量（5、10 μmol/L）效果較好。隨著年齡增長，皮膚細胞中的Q10含量會明顯降低[23]，因此外源性補充輔酶Q10是一種有效對抗皮膚光老化的方法，輔酶Q10微乳可能對紫外輻照后的光老化具有明顯的修復作用。本研究制得的輔酶Q10微乳的透皮吸收能力仍需進一步研究。

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