閔鐘熳，羿麗杰，姜宇（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽110034）

產(chǎn)腸球菌素乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化及其性質(zhì)研究

閔鐘熳，羿麗杰，姜宇
（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽110034）

摘要：以自主分離的一株屎腸球菌BC-3為研究對象，對其代謝產(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間20 h、pH 6.5、接種量1.5%、溫度37℃，抑菌圈直徑可達(dá)17.87 mm。進(jìn)一步經(jīng)硫酸銨沉淀粗提，對腸球菌素E3的部分性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：腸球菌素E3具有很好的耐熱性，超聲波及紫外線短時(shí)處理對其穩(wěn)定性沒有影響，表面活性劑TritionX-114對其活性會有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：屎腸球菌；腸球菌素；發(fā)酵優(yōu)化；性質(zhì)

腸球菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸，屬于乳酸菌。某些腸球菌可以代謝產(chǎn)生細(xì)菌素統(tǒng)稱為腸球菌素。目前已經(jīng)分離和鑒定了許多腸球菌素，其中屎腸球菌（Enterococcus faecium）為主要生產(chǎn)菌，可以代謝產(chǎn)生具有抑菌活性的小分質(zhì)量的類細(xì)菌素，且相關(guān)研究表明這些類細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)[1]、pH作用范圍廣等優(yōu)良的生物學(xué)特性。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自主分離的一株產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌BC-3為研究對象，對其產(chǎn)生腸球菌素E3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對E3的部分生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

屎腸球菌（Enterococcus faecium）BC-3：自主分離；大腸桿菌（Escherichia coli）：沈陽師范大學(xué)創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室保存；培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基[2]。

1.1.2儀器

Thermo（MODEL868）pH計(jì)、Kendor離心機(jī)：美國科峻儀器公司；SW-CJ型超凈工作臺：上海愛明儀器有限公司；DHP-781恒溫培養(yǎng)箱：日本愛朗；YXQ型電熱高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抑菌效果測定

采用濾紙片法[3-4]，取3次試驗(yàn)的平均值。抑菌圈直徑包括濾紙片直徑（6 mm）。

1.2.2單因素試驗(yàn)

1.2.2.1發(fā)酵時(shí)間的影響

將BC-3菌株接入MRS培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵至40 h，在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取樣，測定發(fā)酵液的活菌數(shù)及上清液的抑菌圈直徑，取3次試驗(yàn)平均值。

1.2.2.2培養(yǎng)溫度的影響

保持其他培養(yǎng)條件不變，溫度分別為25、30、37、42℃條件下，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直徑，取3次試驗(yàn)平均值。

1.2.2.3pH的影響

保持其他培養(yǎng)條件不變，pH分別為5、6、7、8條件下，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直徑，取3次試驗(yàn)平均值。

1.2.2.4接種量的影響[5]

保持其他培養(yǎng)條件不變，接種量為1%、2%、3%、4%條件下，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的吸光值及上清液的抑菌圈直徑，取3次試驗(yàn)平均值。

1.2.3正交試驗(yàn)

為了確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合，取發(fā)酵時(shí)間、pH、接種量、溫度四因素三水平進(jìn)行優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表L（934）Table 1　Factors and levels of orthogonal test L（934）

1.2.4腸球菌素E3生物學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.4.1硫酸銨沉淀

粗提腸球菌素E3，采用硫酸銨沉淀法[6]。

1.2.4.2溫度對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

分別取等量的腸球菌素E3粗提液，于EP管中，在60、80、100、120℃下，分別加熱10、20 min，測定溫度對其穩(wěn)定性的影響。

1.2.4.3表面活性劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

將SDS、吐溫20、吐溫80、Trition X-100、Trition X-114加入到E3粗提液中，表面活性劑的終濃度為1%，同體積稀釋原液為對照，37℃保溫5 h，測其抑菌活性。

1.2.4.4超聲波對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

分別取等量的腸球菌素E3粗提液，于EP管中，使用超聲波處理30、60、120、180次，工作功率400 W，工作時(shí)間3 s，間隔時(shí)間4 s，未處理為對照，測抑菌活性。

1.2.4.5紫外線對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

分別取等量的腸球菌素E3粗提液至含磁力攪拌子的無菌平皿中，在距離30 cm、15 W紫外燈下，分別處理0、10、30、60、90 min，測定其對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1發(fā)酵時(shí)間的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響，見圖1。

圖1　發(fā)酵時(shí)間對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.1　Effect of fermentation time on cell growth and enterococcin E3 production

結(jié)果顯示，菌株在4 h～16 h為對數(shù)生長期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，代謝產(chǎn)物不斷積累，隨發(fā)酵時(shí)間的増長而增大，當(dāng)培養(yǎng)至20 h時(shí)，抑菌性最高，此時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大，為16.34 mm。

2.1.2溫度的影響

不同培養(yǎng)溫度對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響，見圖2。

結(jié)果顯示，屎腸球菌BC-3吸光值及腸球菌素E3產(chǎn)量都隨溫度升高而增大，溫度達(dá)到37℃時(shí)，達(dá)到最大值，此時(shí)抑菌圈為16.33 mm。

2.1.3pH的影響

不同的pH對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響，見圖3。

結(jié)果顯示，在較低pH下，菌體生長緩慢，隨pH增加其生長速度及抑菌活性逐漸增加，當(dāng)pH為6時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大，此時(shí)抑菌活性也達(dá)到最大，抑菌直徑為16.24mm。

圖2　溫度對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on cell growth and enterococcin E production

圖3　pH對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of pH value on cell growth and enterococcin E3 production

2.1.4接種量的影響

不同的接種量對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響，見圖4。

圖4 接種量對屎腸球菌BC-3生長及腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of inoculation amount on cell growth and enterococcin E3 production

結(jié)果顯示，隨著接種量加大，菌體濃度增加，當(dāng)接種量為2%時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，此時(shí)抑菌圈的直徑為16.66 mm。

2.2正交試驗(yàn)確定最優(yōu)組合

通過單因素試驗(yàn)，選取發(fā)酵時(shí)間、pH、接種量、溫度，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The results of orthogonal test

由表2結(jié)果可知，各因素對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響程度依次為：發(fā)酵時(shí)間>溫度>pH>接種量。屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的最優(yōu)發(fā)酵組合A2B3C1D2。即：發(fā)酵時(shí)間20 h、pH6.5、接種量1.5%、溫度37℃時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量最高，此條件下的抑菌圈直徑可達(dá)17.87 mm。

2.3腸球菌素E3的性質(zhì)

2.3.1溫度對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

腸球菌素E3粗提液經(jīng)不同溫度處理后，其抑菌活性變化，見圖5。

圖5　溫度對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effect of temperature on the stability of enterococcin E3

由圖5可知，與對照相比，腸球菌素E3經(jīng)不同溫度處理后，對其抑菌活性影響較小。經(jīng)120℃熱處理15 min后，抑菌活性仍保持90%左右。

2.3.2表面活性劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

腸球菌素E3經(jīng)表面活性劑處理后，其穩(wěn)定性見表3。

從表3可知，腸球菌素E3經(jīng)SDS、吐溫20、吐溫80作用后穩(wěn)定性沒有受到影響，而Trition X-100、Trition X-114對其活性有抑制作用，尤其Trition X-114會使其抑菌活性明顯降低。

表3　表面活性劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 3　Influence of surface active agents on the stability of enterococcin E3

2.3.3超聲波對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

腸球菌素E3經(jīng)超聲波處理后，其穩(wěn)定性見表4。

表4　超聲波處理對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 4　Effect of ultrasonic on the stability of enterococcin E3

從表4可知，與對照相比，腸球菌素E3經(jīng)不同程度超聲波處理后，其穩(wěn)定性幾乎沒有受到影響，表明該細(xì)菌素對超聲波處理不敏感。

2.3.4紫外線對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

腸球菌素E3經(jīng)紫外線處理后，其穩(wěn)定性見表5。

從表5可知，30 min內(nèi)紫外線照射對腸球菌素E3穩(wěn)定性沒有影響，隨著處理時(shí)間增加，穩(wěn)定性開始下降，當(dāng)照射90 min后，活性幾乎喪失，因此短時(shí)間內(nèi)紫外線照射對其影響不大。

表5　紫外線照射對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 5　Effect of UV irradiation on the stability of enterococcin E3

3　結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)，對屎腸球菌BC3發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵時(shí)間為20 h、pH為6.5、接種量為1.5%、培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)抑菌活性最高，此時(shí)抑菌圈直徑可達(dá)17.87 mm。進(jìn)一步對腸球菌素E3的部分性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明腸球菌素E3具有耐熱性，超聲波及紫外線短時(shí)處理對其穩(wěn)定性沒有影響，表面活性劑TritionX-114對其活性有一定的抑制作用。以上表明，腸球菌素E3具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，在食品防腐中有很好的應(yīng)用前景。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.040

收稿日期：2014-04-09

基金項(xiàng)目：遼寧省農(nóng)業(yè)青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2015053）；遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（L2012389）

作者簡介：閔鐘熳（1982—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

Study on Optimization of Enterococcin Produced by Lactic Acid Bacteria and Biological Characteristics

MIN Zhong-man，YI Li-jie，JIANG Yu
（College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

Abstract：We studied a Enterococcus faecium BC-3，which is stored in the laboratory，can produced bacteriocins.Fermentation conditions were optimized as follows：fermentation time 20 h，pH6.5，inoculation 1.5%，temperature 37℃，inhibition zone diameter achieved 17.87 mm.Further，to extract E3 with ammonium sulfate，and studied some of its properties.The results showed that：enterococci E3 had good heat resistance，ultrasonic and short-term ultraviolet treatment had no effect on its stability，but a surfactant TritionX-114 had some inhibitory effect on its activity.

Key words：Enterococcus faecium；enterococcin；optimization of fermentation conditions；characteristics