劉海燕，呂蓉，凌晶，劉針鈴，左海根，郭平（江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，江西南昌330000）

GPC凈化-GC-MS法測定烤鰻中硫丹及其代謝物殘留

劉海燕，呂蓉，凌晶，劉針鈴，左海根，郭平
（江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，江西南昌330000）

摘要：建立了烤鰻中α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯殘留的GPC凈化-GC/MS檢測方法。樣品經(jīng)丙酮等溶劑提取，凝膠滲透色譜（GPC）凈化，GC-MS（NCI）檢測和確證。α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯混合標準溶液的質量濃度在0.5 g/L～20 g/L范圍內線性關系良好，在烤鰻中不同質量濃度水平的加標平均回收率為76.9%～86.6%，相對標準偏差（RSD=6）為4.6%～7.6%，檢出限（S/N=3）為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

關鍵詞：凝膠滲透色譜（GPC）；氣相色譜-質譜（GC-MS）；硫丹；硫丹硫酸酯；烤鰻

硫丹（endosulfan）是一種高毒有機氯殺蟲劑，常被廣泛應用于很多農(nóng)作物上，但它的危害性極高，對生殖系統(tǒng)等有損傷和誘變作用[1]。由于農(nóng)業(yè)上的不合理使用及雨水淋溶，硫丹進入環(huán)境后具有較高的持久性，其在植物和土壤中氧化并主要形成的硫丹硫酸酯代謝物與母體化合物毒性相當，在環(huán)境中的半衰期更長，對環(huán)境構成巨大威脅[2]。由于硫丹具有持久性污染、高毒性、生物富集性等特點，已經(jīng)成為一個極具爭議的農(nóng)藥，目前在50多個國家被禁止使用，包括美國、新西蘭、澳大利亞、歐盟、一些亞洲和西非國家。2010年10月，硫丹被納入斯德哥爾摩公約持久有機污染物附件A中，禁止在全球使用和制造。我國烤鰻出口對象國主要集中在日本、韓國，硫丹是日本高度關注的監(jiān)控項目之一，已被實行命令檢查。日本在2006年5月實施的《食品殘留農(nóng)業(yè)化學品肯定列表制度》（簡稱“肯定列表制度”）中規(guī)定水產(chǎn)品中硫丹最大殘留量為0.004 mg/kg。為了保障出口產(chǎn)品的質量，國家質量監(jiān)督檢驗檢疫局總局也將水產(chǎn)品的硫丹列為重點監(jiān)控項目之一。

目前，硫丹殘留量測定方法有氣相色譜法-電子捕獲法[3-5]、氣相色譜-質譜法[6-7]。大多數(shù)采用弗羅里硅土等固相萃取柱凈化?？决牷|較為復雜，富含大量的蛋白質、脂類化合物等，而且殘留物濃度很低，樣品的凈化至關重要，樣品處理不當，會對農(nóng)殘分析產(chǎn)生嚴重干擾。凝膠滲透色譜（GPC）是在農(nóng)藥殘留分析中使用較多的前處理凈化方法，尤其對動物脂肪、牛奶、食用油等富含油脂、蛋白質、色素的樣品凈化效果好[8]，GPC能有效去除烤鰻樣品中的的蛋白質及脂類等大分子干擾物。GPC凈化-GC/MS法測定烤鰻中的硫丹及其代謝物殘留檢測方法國內鮮見報道。該方法靈敏、準確、高效，最低檢出限（S/N=3）達到0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，可滿足烤鰻中硫丹及代謝物殘留的檢測要求。

1　材料與方法

1.1儀器與設備

Agilent 6890氣相色譜儀、Agilent 5975B質譜儀-配備NCI負化學離子源：Agilent公司；Ultra全自動預濃縮-GPC凈化-定量濃縮系統(tǒng)：德國LC Tech公司；IKA ULTRA-TURRAX T25均質器：德國IKA公司；R-215旋轉真空蒸發(fā)裝置：瑞士BUCHI公司；N-EVAP-24氮吹濃縮儀：美國Organomation公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司；ELGA PURE LAB ULTRA MK2超純水一體機：法國威立雅公司；VORTEX GENIE2漩渦混合器：SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BSA2202S電子天平：德國Sartorius公司。

1.2材料與試劑

烤鰻來自于國家質量監(jiān)督檢驗檢疫局總局殘留監(jiān)控計劃抽樣。

丙酮、石油醚（沸程30℃～60℃）、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）：德國CNW公司；氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；3種標準品：α-硫丹（alpha-Endosulfan）、β-硫丹（beta-Endosulfan）及硫丹硫酸酯（Endosulfan sulfate）（純度≥99.0%）：德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

分別準確稱取3種農(nóng)藥標準品0.010 0g，用少量丙酮溶解后，用正己烷定容至100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL標準儲備液。取一定體積的每種農(nóng)藥標準儲備液，用正己烷稀釋成1 μg/mL的混合標準工作溶液，4℃冰箱保存，可使用1個月。檢測前加入正己烷梯度配制成質量濃度分別為20、10、5、2、1、0.5 μg/L的基質標準系列。

1.3.2樣品前處理

取烤鰻可食部分，用組織搗碎機充分搗碎均勻。稱取20.00 g試樣（精確至0.01 g）于250 mL具塞三角瓶中，加超純水6 mL，準確加入丙酮40 mL，以轉速15 000 r/min均質1 min，加入6 g氯化鈉，充分搖勻，再加30 mL石油醚，振蕩30 min。準確吸取35 mL有機層上清液于平底燒瓶中，旋蒸濃縮至約1 mL，加5 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）于平底燒瓶中再濃縮，重復兩次，濃縮液轉移至加25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）定容至刻度，搖勻。通過0.22 μm的有機系濾膜后，轉移至凝全自動預濃縮-GPC凈化-定量濃縮系統(tǒng)上凈化，采用GC-MS（NCI）法檢測和確證。

1.3.3色譜條件

凝膠滲透色譜（GPC）條件：凝膠色譜柱（320 mm× 25 mm）；Bio-Beads S-X3作為柱填料；流動相為環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，體積比）；流速：5 mL/min；進樣體積：5.0 mL；收集時間段：1 080 s～1 800 s；濃縮溫度：40℃；定容體積：2 mL。

氣相色譜（GC）條件：Agilent DB-1701石英毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫條件：50℃保持2 min，以30℃/min速率升至130℃，以10℃/min速率升至260℃，保持5 min，總運行時間22.67 min；進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.3 mL/min；不分流進樣，0.75 min后開閥；進樣量：1.0 μL；溶劑延遲5 min。

質譜（MS）條件：負化學離子源（NCI）；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；反應氣：甲烷氣；選擇離子監(jiān)測方式 SIM；α-硫丹、β-硫丹監(jiān)測離子 m/z為404，406，408，410，定量離子m/z為406；硫丹硫酸酯監(jiān)測離子m/z為384、386、388、390，定量離子m/z為386。

2　結果與分析

2.1凈化條件的確定

2.1.1凈化方式的選擇

除去油脂是非常關鍵的步驟，通常采用超低溫冷凍除脂[9-10]、固相萃取（SPE）柱[11-14]和凝膠滲透色譜（GPC）凈化[15-17]。本試驗考察了-18℃冷凍除脂聯(lián)合C18固相萃取柱（C18SPE，1 g/6 mL）、石墨化碳黑固相萃取柱（GCB SPE，500 mg/3 mL）串聯(lián)中性氧化鋁固相萃取柱（Al2O3SPE，1.0 g/3 mL）、GPC凈化這3種凈化方式對烤鰻加標樣品凈化的除油效果和回收率情況。結果：GPC凈化效果最好，洗脫液中基本沒有油脂，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯回收率均達70%以上；-18℃冷凍除脂聯(lián)合C18SPE柱凈化回收率僅有35%，原因可能為在-18℃冷凍下去除大部分油脂時，一同去除了部分目標化合物；GCB SPE柱串聯(lián)Al2O3SPE柱除油效果差，洗脫液中仍含有大量的油脂，檢測時對色譜柱損害大、響應驟降。

2.1.2GPC凈化的條件優(yōu)化

本試驗將添加100 μg/L的烤鰻樣品提取液，過GPC凈化，通過收集GPC不同時間段的流出液，觀察其含油量的變化及用GC-MS分析含量。試驗結果表明，烤鰻提取液中的蛋白質及脂類等大分子干擾物基本流出的時間為1 080 s，目標物集中在1 080 s～1 800 s流出，目標物流出曲線見圖1。

圖1　硫丹及硫丹硫酸酯在GPC條件下的回收率Fig.1　Recoveries of endosulfan and endosulfan sulfate by GPC

因此，本試驗最終選用GPC凈化烤鰻提取液，收集1 080 s～1 800 s流出液。

2.2檢測方式的選擇

硫丹是全球禁止使用的藥物，日本在“肯定列表制度”中規(guī)定水產(chǎn)品中硫丹最大殘留量為0.004 mg/kg，檢測對儀器的靈敏度要求較高?？紤]到硫丹及其代謝物具有很強的電負性，GC-MS（NCI）對該物質具有很高的靈敏度，且質譜法為確證方法，對結果的判斷優(yōu)于氣相法。本試驗采用烤鰻樣品進行添加回收試驗，樣品經(jīng)處理后用GC-MS（NCI）測定，回收率均達到70%以上，標準、經(jīng)GPC凈化的加標（10 μg/kg）烤鰻樣品及空白烤鰻樣品色譜圖如圖2所示。

圖2　標準、經(jīng)GPC凈化的加標（5 μg/kg）烤鰻樣品及空白烤鰻樣品色譜圖Fig.2　Chromatogram of standard，spiked eel sample（5 μg/kg）with GPC purification and blank eel sample

從譜圖可看出基質中不含有硫丹和硫丹硫酸酯，無干擾成分存在。因此本試驗采用GC-MS（NCI）檢測和確證。

2.3線性范圍和檢出限

在最佳試驗條件下，取一系列不同質量濃度的α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯標準混合溶液，以儀器響應峰面積對混合標準的質量濃度作標準曲線。結果顯示，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的質量濃度在0.5 μg/L～2 μg/L范圍內線性關系良好，各組分的線性范圍、線性回歸方程及相關系數(shù)見表1。

表1　回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)和檢出限Table 1　Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and detection limits

根據(jù)3倍信噪比測得3種分析物的檢出限為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

2.4回收率和精密度

在不含農(nóng)藥的烤鰻樣品中分別添加低、中、高3個水平的3種農(nóng)藥混合標準工作溶液，平行測定6次，結果，3種分析物的平均回收率為76.9%～86.6%，相對標準偏差為4.6%～7.6%，具體結果如表2所示。

表2　3種農(nóng)藥在烤鰻中的添加回收率和精密度（n=6）Table 2　Recoveries and precision of 3 pesticides in eel（n=6）

2.5實際樣品分析

應用所建立的GPC凈化-GC-MS法檢測了2014年國家質檢總局殘留監(jiān)控計劃中規(guī)定的烤鰻中硫丹及其代謝物的殘留，共檢測88批次烤鰻樣品進行檢測，硫丹（以α-硫丹、β-硫丹及硫丹代謝物硫丹硫酸酯總量計）檢出率達17.9%，其中殘留量最高達0.025 mg/kg，主要檢出為硫丹硫酸酯殘留超標，超過了日本“肯定列表制度”規(guī)定的鰻魚中硫丹最大殘留限量0.004 mg/kg的要求。

3　結論

本文建立了應用GPC凈化-GC/MS法測定烤鰻中硫丹及其代謝物殘留的方法。樣品經(jīng)丙酮等提取，凝膠滲透色譜凈化，GC/MS檢測和確證，外標法定量。通過大量烤鰻樣品試驗驗證，α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯的線性關系良好，在烤鰻中不同質量濃度水平的加標平均回收率為76.9%～86.6%，相對標準偏差（RSD=6）為4.6%～7.6%，方法的檢出限（S/N=3）為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，該方法具有高效、定性準確、靈敏度高等特點，可滿足烤鰻中硫丹及代謝物殘留的檢測限量要求。

硫丹殘留在水產(chǎn)品中的高檢出率，可能是由于水源受硫丹污染，硫丹在水中很快被污泥和水生生物吸附，繼而造成養(yǎng)殖環(huán)境污染和水產(chǎn)品中的殘留超標。硫丹殘留問題應引起水產(chǎn)品養(yǎng)殖管理部門及相關企業(yè)的重視。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.031

收稿日期：2014-12-29

基金項目：江西省青年科學基金項目（20142BAB213028）

作者簡介：劉海燕（1984—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事食品質量安全檢測工作。

Determination of Endosulfan and Its Metabolites Residues in Roasted Eel by GC/MS with GPC Purification

LIU Hai-yan，Lü Rong，LING Jing，LIU Zhen-ling，ZUO Hai-gen，GUO Ping
（Technical Center of Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanchang 330000，Jiangxi，China）

Abstract：An analytical method for the determination of alpha-Endosulfan，beta-Endosulfan and Endosulfan sulfate residues in Roasted Eel by GPC-GC/MS.Samples were extracted with acetone and other solvents，purified by GPC，then determined by GC-MS（NCI）.Good linear relationships were obtained between the peak areas and the concentrations of alpha endosulfan，beta-endosulfan and endosulfan sulfate within the range of 0.5 g/L-20 g/L.The recovery of standard addition of pesticides in different concentration levels in roasted eel rate respectively were 76.9%-86.6%，relative standard deviation（RSD=6）was 4.6%-7.6%.Method detection limit（S/N=3）was 0.01 μg/kg-0.03 μg/kg.

Key words：gel permeation chromatography（GPC）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；endosulfan；endosulfan sulfate；roasted eel