王瑩，張海珠，*，劉熙，李楊（.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理67000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理67000）

云南松松塔多糖含量測(cè)定兩種方法的比較

王瑩1，2，張海珠1，2，*，劉熙1，2，李楊1
（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

摘要：通過(guò)對(duì)云南松松塔中多糖的含量的測(cè)定，比較硫酸-蒽酮和硫酸-苯酚兩種常用多糖測(cè)量方法。通過(guò)精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等方面，對(duì)硫酸-蒽酮和硫酸-苯酚兩種常用多糖測(cè)量方法進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：硫酸-苯酚法在云南松松塔多糖含量測(cè)定中較硫酸-蒽酮法優(yōu)越，硫酸-苯酚法測(cè)定云南松松塔多糖含量時(shí)，操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性高，為云南松松塔等植物的多糖含量測(cè)定提供了參考。

關(guān)鍵詞：云南松；松塔；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法；多糖含量

松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的球果，別名松果、松球，其植物來(lái)源有華山松、云南松、紅松、油松及思茅松等[1]，松塔具有祛痰、止咳、平喘等功效[2]，而分布在云南的云南松（Pinusyunnanensis Faranch）資源十分廣泛，但藥用價(jià)值卻未得到有效地開(kāi)發(fā)利用。本文對(duì)采集于云南省大理市的云南松松塔進(jìn)行研究，測(cè)量其多糖含量，為云南松松塔的藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1研究對(duì)象

云南松松塔樣品于2013年8月采集于云南省大理市斜陽(yáng)峰，標(biāo)本由大理學(xué)院段寶忠副教授鑒定，粉碎，過(guò)60目篩，置于陰暗處備用。

1.2主要儀器

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AL104電子分析天平：梅特勒一托利多儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京浦西通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.3主要試劑

葡萄糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%，批號(hào)20130408；蒽酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%，批號(hào)20131011；苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

2　方法

2.15%苯酚溶液的配制

精密稱取苯酚10 g，加入200mL水溶解，完全溶解后放置于棕色瓶保存，備用。

2.2硫酸-蒽酮溶液的配制

精密稱取蒽酮4mg，加入80%200mL硫酸溶解，完全溶解后放置于棕色瓶保存，備用。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取葡萄糖50.00mg，置于50mL容量瓶溶解，定容，得1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.4樣品溶液的配制

精密稱取樣品10mg，置于50mL容量瓶溶解，定容，得樣品溶液，備用。

2.5測(cè)量波長(zhǎng)的選擇。

2.5.1硫酸-蒽酮法

精密移取1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品溶液各1mL，分別置于兩個(gè)10mL容量瓶中，各加入7mL硫酸-蒽酮溶液，冷卻至室溫后定容，再次冷卻至室溫，100℃沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，另取1mL蒸餾水以同樣方法做空白對(duì)照，進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)500nm～700 nm[3]。圖1顯示得到，測(cè)量波長(zhǎng)為622 nm。

圖1　樣品溶液與葡萄糖溶液的紫外吸收光譜（硫酸-蒽酮法）Fig.1　TheUV absorption spectra ofsam ple solution and glucose solution（sulfuric acid-anthronemethod）

2.5.2硫酸-苯酚法

精密移取1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品溶液各1mL，分別置于兩個(gè)10m L容量瓶中，各加入5%苯酚溶液1mL，5mL濃硫酸，冷卻至室溫后定容，再次冷卻至室溫，100℃沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，另取1mL蒸餾水以同樣方法做空白對(duì)照，進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)400 nm～550 nm[4]。圖2顯示得到，測(cè)量波長(zhǎng)為490 nm。

圖2　樣品溶液與葡萄糖溶液的紫外吸收光譜（硫酸-苯酚法）Fig.2　TheUV absorption spectra ofsam ple solution and glucose solution（sulfuric acid-phenolm ethod）

3　結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

3.1.1硫酸-蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL置于10mL容量瓶中，加入7mL硫酸-蒽酮溶液，冷卻至室溫后定容，再次冷卻至室溫，100℃沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，另取1mL蒸餾水以同樣方法做空白對(duì)照，進(jìn)行光度測(cè)量，測(cè)量波長(zhǎng)為622 nm。以吸光度A為縱坐標(biāo)Y，以溶液濃度C為橫坐標(biāo)X，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=16.177X-0.075 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。測(cè)定結(jié)果顯示，葡萄糖在10μg/m L～110μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2硫酸-苯酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.75、1.25、1.75、2.25mL置于10mL容量瓶中，1mL 5%苯酚溶液，5mL濃硫酸，冷卻至室溫后定容，再次冷卻至室溫，100℃沸水浴加熱10min，冷卻至室溫，另取1m L蒸餾水以同樣方法做空白對(duì)照，進(jìn)行光度測(cè)量，測(cè)量波長(zhǎng)為490 nm。以吸光度A為縱坐標(biāo)Y，以溶液濃度C為橫坐標(biāo)X，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2.06X+0.032 8，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 7。測(cè)定結(jié)果顯示，葡萄糖在10μg/mL～90μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1硫酸-蒽酮法方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD=0.64%。

精密移取樣品溶液1mL，按照2.5.2方法進(jìn)行操作，得到重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，得樣品中多糖含量的平均含量為549μg/g，結(jié)果RSD=2.91%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)，每隔4 h測(cè)定樣品液，連續(xù)考察24 h，RSD=1.67%。硫酸-蒽酮法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1　硫酸-蒽酮法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table1　The resultsofaverage recovery ofsulfuric acid-anthrone m ethod

由表1可知，回收率試驗(yàn)顯示，所測(cè)樣品回收率平均值為99.68%，RSD=1.05%。

3.2.2硫酸-苯酚法方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD=0.28%。

精密移取樣品溶液1mL，按照2.5.2方法進(jìn)行操作，得到重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，得樣品中多糖含量的平均含量為584μg/g，結(jié)果RSD=1.51%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)，每隔4 h測(cè)定樣品液，連續(xù)考察24 h，RSD=1.14%。

硫酸-苯酚法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　硫酸-苯酚法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table2　The resultsof average recovery of sulfuric acid-phenol m ethod

由表2可知，回收率試驗(yàn)顯示，所測(cè)樣品回收率平均值為99.57%，RSD=1.43%。

綜上所述，通過(guò)對(duì)精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等的考察，對(duì)比了硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法兩種常用多糖測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸-苯酚法所測(cè)云南松松塔多糖精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，雖然回收率較硫酸-蒽酮法略有不足，但相差不是很大，是目前測(cè)定云南松松塔多糖較為理想的方法。

3.3樣品含量測(cè)定

用硫酸-苯酚法對(duì)松塔多糖樣品進(jìn)行測(cè)定，依照2.5.2方法進(jìn)行操作，測(cè)得云南松松塔多糖粗提物的含量為58.41%。

4　討論

1）硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法在測(cè)定松塔多糖的過(guò)程中，回收率試驗(yàn)方面，硫酸-苯酚法雖較硫酸-蒽酮法略有不足，但精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，操作簡(jiǎn)單，適合松塔及其制品的多糖含量常規(guī)測(cè)定。

2）硫酸-蒽酮法測(cè)量多糖含量的關(guān)鍵在于，蒽酮在空氣中易氧化變質(zhì)，因此蒽酮溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用[5]，而硫酸-苯酚法在于苯酚的重結(jié)晶，去除其中被氧化的的醌類(lèi)雜質(zhì)，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性[6]。

利用硫酸-苯酚法測(cè)定松塔多糖的方法，所需儀器簡(jiǎn)單，藥品價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，利于推廣，對(duì)于云南松松塔多糖的藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.038

收稿日期：2014-06-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81260632）；云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（云南松松塔多糖的分離純化及免疫活性研究）；大理學(xué)院應(yīng)用開(kāi)發(fā)科研基金（KYYY201304）

作者簡(jiǎn)介：王瑩（1981—），女（漢），講師，在讀博士，研究方向：主要從事中藥活性研究。

*通信作者：張海珠，講師,主要從事中藥及天然藥物活性及質(zhì)量控制研究。

Com parison of Two M ethods of Determ ination in the Pinecone of Pinus yunnanensis

WANGYing1，2，ZHANGHai-zhu1，2，*，LIUXi1，2，LIYang1
（1.College of Pharmacology，DaliUniversity，Dali671000，Yunnan，China；2.Yunnan Provincial Key LaboratoryofEntomological BiopharmaceuticalR&D，Dali671000，Yunnan，China）

Abstract：Determination of the content in the cloud Nansongsongta polysaccharides，more sulfuric acidanthrone and sulfuric acid-phenol two common polysaccharidemeasurementmethod.By aspects of precision test，stability test，recovery testofsulfuric acid，sulfuric acid-anthrone and sulfuric acid-phenol two common polysaccharidemeasurementmethodswere compared.Sulfuric acid-phenolmethod in the determination of the polysaccharide content cloud Nansongsongta than sulfuric acid-excellent anthrone method.Sulfuric acid-the determination of the polysaccharide content cloud Nansongsongta phenol method，simple operation，high precision，stability，and other plants for the determination of the cloud Nansongsongtapolysaccharide content to provide a reference.

Key words：Pinus yunnanensis Faranch；pinecone；sulfuric acid-phenol method；sulfate acid-anthrone method；polysaccharide content