王明陽，李璠，解瑞林，韓寒冰，劉杰鳳

（1.茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名525000）

柱層析法連續(xù)提取葡萄籽油和多酚的工藝技術(shù)

王明陽1，李璠1，解瑞林1，韓寒冰2，*，劉杰鳳2

（1.茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名525000）

摘要：研究連續(xù)提取并分離葡萄籽中的葡萄籽油和多酚的最佳工藝條件。將干燥的葡萄籽粉末用石油醚濕潤裝進(jìn)層析柱中，浸泡2h，先后用石油醚和60%乙醇溶液連續(xù)洗脫，連續(xù)收集石油醚6倍體積（mL/g）和60%乙醇溶液10倍體積洗脫液，混合洗脫液分層，醚層中含有葡萄籽油，下層醇水液中含有多酚。連續(xù)提取的葡萄籽油和多酚的提取率均達(dá)到99%，經(jīng)萃取一次性分離葡萄籽油和多酚，得率分別是97.6%和98.0%。利用柱層析連續(xù)提取葡萄籽油和多酚，并通過萃取可把兩種成分一次性分離開來，工藝簡單，時(shí)間短，有機(jī)溶劑用量少，提取效率高，具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：葡萄籽；柱層析；連續(xù)提?。黄咸炎延?；多酚

我國每年有近500萬t的葡萄用于釀酒，釀酒后產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品葡萄籽，一般葡萄的出籽率為8%～10%[1-3]，釀酒后的葡萄籽中含有大量的功能性成分，如葡萄籽油和多酚化合物。葡萄籽含油量為14%～19%，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，在不飽和脂肪酸中又以亞油酸為主，其含量在58%～78%之間[4]。亞油酸人體必需而又不能合成的脂肪酸。葡萄籽油能降低紫外線的傷害、保護(hù)肌膚中的膠原蛋白、改善靜脈腫脹與水腫以及預(yù)防黑色素沉淀，而且還能調(diào)節(jié)人體自主神經(jīng)、營養(yǎng)腦細(xì)胞、促進(jìn)兒童生長發(fā)育等，是營養(yǎng)價(jià)值很高的保健營養(yǎng)品，宜長期食用，可作為高級(jí)食用油及化妝品原料[5]。葡萄籽中含有多種多酚類化合物，主要為兒茶素、槲皮苷、原花青素、單寧等?？蓪⒍喾臃譃樯睾蜔o色多酚兩大類，色素主要有花色素和黃酮兩類，無色多酚主要分為酚酸（苯酸類和苯丙酸類）、聚合多酚（兒茶素和原花色素）及單寧（縮合單寧和水解單寧）等。多酚類物質(zhì)廣泛存在于自然界中，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等生物活性功能[6]。

目前，對(duì)葡萄籽油和多酚的提取常用溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取法、加壓液相萃取法和酶提取法等[7-9]。但以上方法都普遍存在工藝都比較復(fù)雜、提取時(shí)間長、溶劑用量大、成本高或分離純化程序復(fù)雜等缺陷。此外，提取只針對(duì)性其中的葡萄籽油或多酚化合物，難免造成材料和溶劑的浪費(fèi)。本研究利用柱層析循環(huán)法能同時(shí)高效提取和分離葡萄籽油和多酚類化合物，具有溶劑消耗量少、提取效率高、處理時(shí)間短和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

將釀酒后的廣西野生葡萄籽洗凈，將其置于50℃的干燥箱中烘干至恒重，粉碎，過40目篩得到葡萄籽粉末，備用。

福林-肖卡試劑（Folin-Ciocalteu）：稱取鎢酸鈉5 g，鉬酸鈉1.25 g，用水35mL溶于100mL回流瓶中，加入磷酸（H3PO4≥85%）2.5mL及5mL濃鹽酸（37%），充分混勻，小火加熱回流2 h，再加入硫酸鋰7.5 g，蒸餾水2.5mL及數(shù)滴溴水后，開口繼續(xù)沸騰15min，使溴水完全揮發(fā)為止，冷卻后定容至50 m L，過濾，置于棕色瓶中，用時(shí)加入1倍蒸餾水。

7.5%碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉3.75 g溶于25m L溫水中，混勻，冷卻，稀釋至50m L。

1.1.2儀器

玻璃層析柱：廣州市東征化玻有限公司；DL-6000低速冷凍大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200B超聲波清洗器：江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.2葡萄籽油和多酚含量測定

重量法測定葡萄籽油的含量。Folin-Ciocalteau法[10]測定多酚的含量，以沒食子酸為對(duì)照品，用純水配成梯度濃度分別為50、100、150、200、250、300μg/mL的多酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，在765 nm波長下檢測，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3提取條件

1.3.1葡萄籽油提取條件的確定

稱取0.5g葡萄籽粉末6份，分別加入石油醚5mL，室溫內(nèi)搖床振蕩（200 r/min），浸泡時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4、5 h，到時(shí)取出，6 000 r/min低溫離心10min，分別測定上清液體積，用總體積（5mL）減去上清液體積，計(jì)算1 g材料吸收溶劑量（mL），即吸漲率；減壓濃縮至恒重后，于電子分析天平上稱量，計(jì)算得率。確定葡萄籽油在石油醚中溶解達(dá)到平衡的浸泡時(shí)間。

1.3.2多酚提取條件

將乙醇和水配制成體積分?jǐn)?shù)分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，稱取葡萄籽粉末0.5 g6份分別于10mL提取管中，加入相應(yīng)濃度的乙醇溶液5mL，室溫內(nèi)搖床振蕩（200 r/min）1 h，6 000 r/min低溫離心10min，檢測多酚的含量。

確定吸漲率和浸泡時(shí)間

稱取0.5 g葡萄籽粉末6份，分別加入60%乙醇5 m L，室溫內(nèi)搖床振蕩（200 r/min），浸泡時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4、5 h，到時(shí)取出，6 000 r/min低溫離心10 min，分別測定上清液體積，用總體積（5mL）減去上清液體積，計(jì)算1 g材料吸收乙醇溶液量（m L），即吸漲率；測定上清液中多酚含量，確定多酚在乙醇中溶解達(dá)到平衡的浸泡時(shí)間。

1.4柱層析法提取葡萄籽油和多酚

1.4.1柱層析法[11-14]分別提取葡萄籽油和多酚

選取直徑為1.25 cm的玻璃層析柱，準(zhǔn)確稱取葡萄籽粉末5 g，石油醚濕樣上柱，保持石油醚沒過樣品，室溫靜置2 h，以吸漲體積（15mL）為一個(gè)收集單位（即一份），以每小時(shí)收集一份的流速進(jìn)行收集，共收集3份，殘?jiān)?jīng)超聲1 h，抽濾再得到一份提取液，分別測定各份葡萄籽油的含量。同樣方法，用60%乙醇上樣，收集3份乙醇提取液和1份殘?jiān)崛∫海糠?5mL），分別測定各份多酚的含量。

1.4.2柱層析連續(xù)提取葡萄籽油和多酚

開始階段與1.4.1項(xiàng)下的方法相同，不同的是收集完兩份石油醚洗脫液（共30mL）后，繼續(xù)收集60%乙醇洗脫液兩份（共50mL）。

1.5葡萄籽與多酚的分離

合并1.4.2項(xiàng)下收集的提取液（石油醚30mL，乙醇溶液50mL），分液漏斗萃取，上層醚層含有葡萄籽油，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥，重量法測油量；下層醇水液中含多酚，稀釋測定其多酚含量。

2　結(jié)果與分析

2.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1是沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

沒食子酸含量的回歸方程為：y=0.001 6x+0.009 2 （R2=0.9991），說明線性關(guān)系良好，線性范圍在50μg/mL～350μg/mL之間。

2.2提取工藝條件

乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響見圖2。

圖1　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard solution curvesofgallic acid

圖2　乙醇濃度對(duì)多酚提取效率的影響Fig.2　Affectof ethanol concentration on the extraction rateof polyphenol

從圖2可以看出，水的提取率很低，隨著乙醇濃度的增大，提取率增大，60%的提取率與80%的提取率接近，純乙醇的提取率反而降低。因此，選擇60%的乙醇溶液作為多酚提取洗脫液。

樣品材料對(duì)不同溶劑的吸收性能不同，見圖3。

圖3石油醚和60%乙醇的吸漲率Fig.3　Imbibed rateof petroleum etherand 60%ethanol

從圖3可以看出，葡萄籽粉末浸泡1 h后吸收量均達(dá)到最大。石油醚和60%乙醇溶液的吸漲率分別接近3倍和5倍（mL/g），因此，石油醚和乙醇溶液分別以3倍體積和5倍體積為1份作一個(gè)洗脫液收集單位。

經(jīng)過不同時(shí)間的浸泡，溶液中葡萄籽油或多酚的含量變化見圖4。

圖4 浸泡時(shí)間的測定Fig.4　Determ ination of soaking time

在2 h葡萄籽油和多酚的含量均達(dá)到最大，浸泡時(shí)間增加，含量也不再增大，說明浸泡2 h后，目標(biāo)成分在相應(yīng)的溶劑中已充分溶解達(dá)到平衡。因此，可以確定材料在層析柱中浸泡時(shí)間為2 h。

2.3分別提取葡萄籽油和多酚的效率

圖5是用柱層析法分別提取葡萄籽油和多酚的提取率圖。

圖5　分別提取葡萄籽油和多酚的提取率Fig.5　Extraction rateofgrapeseed oiland polyphenolby Independent

測定收集的各份葡萄籽油或多酚的含量，以3份提取液和殘?jiān)暮靠偤涂醋魇悄繕?biāo)成分的總含量，結(jié)果葡萄籽油和多酚占干重的百分含量分別為16.8% 和6.65%。從圖5中可以看出，無論是葡萄籽油或多酚，其第1份和第2份的提取率相加均超過99%，因此在收集洗脫液時(shí)，只需要收集第1和第2份就能基本把目標(biāo)成分提取出來。

2.4連續(xù)提取葡萄籽油和多酚的效率

連續(xù)收集石油醚提取液30mL和60%乙醇溶液50mL，合并萃取，一次性把兩種成分分離開來，分別作定量分析，結(jié)果見表1。

表1　連續(xù)提取測定葡萄籽油和多酚的含量Table1　Contentof grapeseed oiland polyphenolby sequential extraction

葡萄油的含量16.41%，多酚含量6.51%，得率分別是97.6%和98.0%。

3　討論

葡萄籽油和多酚的提取常用溶劑萃取法[4]，超聲波輔助[4-5]、超臨界CO2萃取法[7，15]等，各文獻(xiàn)報(bào)道的最佳提取工藝條件也差別很大。李瑞麗等[5]對(duì)葡萄籽中多酚的超聲提取工藝進(jìn)行了研究，最佳工藝條件為在40℃條件下，以料液比為30∶1的40%乙醇溶液，用120W的超聲功率對(duì)葡萄籽作用10min。郭雄飛等[6]最佳提取條件是12倍體積60%乙醇超聲提取4次，40min/次，提取率可達(dá)95%以上。顯然，都存在料液比很大，后者還存在提取時(shí)間長，次數(shù)多等缺點(diǎn)。柱層析法原理是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)上的不同（如分子大小、形狀、極性和分配系數(shù)等），使各組分以不同濃度和不同的速度從固體材料中到流動(dòng)相中，提取液即流動(dòng)相分子在充滿材料的柱體中從上而下流動(dòng)，洗脫它所流經(jīng)的材料顆粒，與浸泡提取相比，效率高，溶劑少，提取徹底。并可通過用不同極性的溶劑連續(xù)把葡萄籽油和多酚提取出來。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，通過柱層析連續(xù)提取，3倍體積石油醚和5倍體積的60%乙醇就可把92%以上的葡萄籽油和多酚提取出來，如提取液加倍，提取率就能達(dá)到99%以上；而且只需通過簡單的萃取即可把兩成分分離開來，再通過減壓回收石油醚和乙醇，即可得到葡萄籽油和多酚粗產(chǎn)品。因此，柱層析法連續(xù)提取既節(jié)省大量溶劑，同時(shí)也減少后續(xù)的濃縮工序，成本低，功能成分損失少，效率高，是一個(gè)適合應(yīng)用到提取分離葡萄籽油和多酚的工藝技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]高璐,胡博然,祁妤琳,等.葡萄籽油提取工藝研究及對(duì)其理化性質(zhì)的影響[J].食品科學(xué),2009,30(22):81-83

[2]FMATTIVI,U VRHOVSEK,DMASUERO,etal.Differences in the amountand structure of extractable skin and seed tannins amongst red grape varieties[J].Australian Journal of Grape and Wine Research,2009,15(1):27-35

[3]Maier T,Schieber A,Kammerer DR,etal.Residues of grape(Vitis vinifera L.)seed oilproduction asa valuable source ofphenolic antioxidants[J].Food Chemistry,2009,112(3):551-559

[4]趙芙蓉,康健,陳茵茹.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波強(qiáng)化復(fù)合溶劑提取葡萄籽油工藝[J].食品科學(xué),2013,134(14):40-44

[5]李瑞麗,喬五忠,王艷輝,等.葡萄籽原花青素的超聲提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2006,27(2):64-66

[6]郭雄飛,倪慧,卿德剛,等葡萄籽中多酚類物質(zhì)的提取和純化工藝[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2009,18(4):351-354

[7]趙軍.響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽油超臨界CO2萃取工藝條件的研究[J].中國釀造,2010(2):135-137

[8]周雯雯,王純榮,余莉莉.超聲波輔助提取葡萄籽油的工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(6):90-92

[9]Haseeb N,John S,GauriS.M.Extraction of polyphenols from grape seedsand concentration by ultrafiltration[J].Separation and Purification Technology,2006,48(2):176-181

[10]Singleton VL,Rossi JA.Colorimetry of total phenlicswith phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J].Am JEnol Vitic,1965, 16(3):144-158

[11]Wang L,Gong LH,Chen CJ,etal.Column chromatographic extraction and separation ofpolyphenols,caffeine and theanine from green tea[J].Food Chem istry,2012,131(8):1539-1545

[12]Zhan PY,Zeng XH,Zhang HM,et al.High-efficient column chromatographic extraction of curcumin from Curcuma longa[J].Food Chemistry,2011,129(2):700-703

[13]韓寒冰,周天,劉杰鳳,等.柱層析循環(huán)法聯(lián)合提取臍橙皮中橙皮苷與多糖的工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(20):260-264

[14]Han HB,Li H,Hao RL,et al.One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles,flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis[J]. Food Chemistry,2014,145(2):542-548

[15]張連富,牟德華,杜彥山.超臨界流體萃取法提取葡萄籽油工藝的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2007,22(2):60-62,65

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.033

收稿日期：2014-05-28

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020503069）

作者簡介：王明陽（1977—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品檢測與開發(fā)。

*通信作者

Sequential Extraction of Oil and Polyphenols from G rape Seed by Colum n Chrom atography M ethod

WANGMing-yang1，LIFan1，XIERui-lin1，HANHan-bing2，*，LIU Jie-feng2
（1.Maoming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Maoming525000，Guangdong，China；2.College ofEnvironmentaland Biological Engineering，Guangdong UniversityofPetrochemicalTechnology，Maoming 525000，Guangdong，China）

Abstract：To explore technical process and conditions for the sequential extraction of grape seed oil and polyphenol by using column chromatography from grape seed.Dried material was loaded into a column with petroleum etherand sequentiallyeluted with 6-fold（mL/g）petroleum ether，10-fold 60%（v/v）ethanol.The eluteswas separated into an ether fraction containing grape seed oil and an ethanol-water fraction containing polyphenol.Through this procedure，grape seed oiland polyphenol in grape seed were simultaneously extracted at99%extraction ratesand simply separated athigher than 97.6%and 98.0%recovery rates.The processwas simple and short，with lessconsumption ofsolventsand high extraction rates.Themethod providesasimpleand high-efficientextraction and separation ofwide rangebioactivesubstances.

Keywords：grape seed；column chromatography；sequentialextraction；grapeseed oil；polyphenol