曹愛玲，沈立，蔡路昀，張建人（.蕭山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州208；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州20；.杭州蕭山天福生物科技有限公司，浙江杭州208）

中華鱉粉中氨基脲來源及相關(guān)性分析

曹愛玲1，沈立1，蔡路昀2，*，張建人3
（1.蕭山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江杭州311208；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；3.杭州蕭山天福生物科技有限公司，浙江杭州311208）

摘要：研究不同處理?xiàng)l件下中華鱉粉中氨基脲（SEM）殘留呈陽性的原因。研究從養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、加工環(huán)節(jié)全鏈條分析氨基脲的可能來源。結(jié)果表明，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用消毒劑與SEM呈陽性無關(guān)。高溫烘干會(huì)導(dǎo)致氨基脲呈陽性，且隨著烘干溫度的升高，氨基脲檢出值也隨之升高。中華鱉不同部位組織的氨基脲生成量存在著明顯差異，總體上鱉肉的SEM生成量高于鱉骨，但130℃高溫烘干時(shí)鱉骨的SEM含量要高于鱉肉；進(jìn)一步的蛋白質(zhì)分析表明，氨基脲的產(chǎn)生和樣品的蛋白質(zhì)含量和組成密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：中華鱉；氨基脲；消毒劑；蛋白質(zhì)

氨基脲（Semicarbazide，SEM）是呋喃西林的代謝產(chǎn)物，其與蛋白緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物質(zhì)。氨基脲結(jié)構(gòu)簡單，來源廣泛，在食品生產(chǎn)加工過程中都可以產(chǎn)生[1-2]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的食品中氨基脲的來源主要有獸藥呋喃西林的代謝物[3]、以偶氮二甲酰胺為發(fā)泡劑制作的食品接觸材料[4]、以及在食品車間和農(nóng)業(yè)上使用次氯酸鹽進(jìn)行衛(wèi)生處理和消毒產(chǎn)生的氨基脲[5]等。我國是水產(chǎn)大國，每年有大量的水生動(dòng)物源性產(chǎn)品出口，天然海捕水產(chǎn)品中曾檢出了氨基脲，如海捕蝦仁中檢出氨基脲，這顯然不能用呋喃西林的代謝物來解釋其來源。有研究認(rèn)為，甲殼類水產(chǎn)品中含氨基脲極有可能就是動(dòng)物自身產(chǎn)生的，并不是違規(guī)用藥的結(jié)果[2]。

中華鱉（Pelodiscus sinensis）屬龜鱉目（Testudinata）鱉科（Trionychidae）鱉屬（Trionyx），俗稱甲魚。我國是中華鱉的養(yǎng)殖和出口大國，由于活體中華鱉存在銷售周期短、產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)高、附加值低等不利因素影響，國內(nèi)企業(yè)正在向著中華鱉深加工產(chǎn)品-中華鱉粉方向發(fā)展，這既可出口創(chuàng)匯，又可減輕鮮活中華鱉面對市場的銷售壓力，促進(jìn)中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。然而在原料最終加工成中華鱉粉后卻出現(xiàn)了呋喃西林代謝物氨基脲殘留呈陽性現(xiàn)象，嚴(yán)重困擾和制約中華鱉粉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此研究中華鱉粉加工過程中氨基脲生成量的差異及其相關(guān)性分析，對于有效控制氨基脲的產(chǎn)生，維護(hù)消費(fèi)者健康以及保護(hù)我國出口貿(mào)易具有重要意義。本研究從中華鱉養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、到加工環(huán)節(jié)，全程跟蹤分析，考查了不同養(yǎng)殖條件、不同加工條件下中華鱉組織樣品氨基脲生成量的差異，查找呋喃西林代謝物檢出陽性的原因，為中華鱉粉生產(chǎn)過程中氨基脲的控制提供理論參考。

1　材料和方法

1.1儀器與試劑

Alpha 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī)：德國Christ公司；DGX-9143B-1型電熱循環(huán)烘箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司；DJ-04BDJ-04型不銹鋼粉碎機(jī)：上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；Revco ULT-1786型超低溫冰箱：美國Thermo公司；Xevo TQ-S型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Waters公司；Kjeltec 8400凱氏定氮儀：瑞典Foss公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；呋喃西林（純度≥99%）：Sigma公司；氨基脲鹽酸鹽和氨基脲同位素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈等都為色譜純；其余化學(xué)試劑都為分析純。

1.2方法

本試驗(yàn)從養(yǎng)殖和加工2個(gè)環(huán)節(jié)分析SEM陽性的可能來源。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，用陽性藥物添加組作為對照，同時(shí)再另設(shè)2個(gè)試驗(yàn)組，分別是消毒劑處理組和非消毒劑處理組，用于研究消毒劑是否對SEM產(chǎn)出造成影響。在加工環(huán)節(jié)，將中華鱉分成肉、骨2部分，并設(shè)定凍干、100、130℃3種條件下制成中華鱉粉。研究溫度及中華鱉自身不同成分對SEM生成的影響。

1.2.1前期準(zhǔn)備

試驗(yàn)飼料：本試驗(yàn)期間所用飼料為出口中華鱉養(yǎng)殖場單獨(dú)加工配制，不添加任何藥物（陽性對照組飼料除外），飼料經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測不含呋喃西林；試驗(yàn)用水：本試驗(yàn)期間所用養(yǎng)殖及加工用水均為自來水，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測不含呋喃西林，排除地下水等可能的環(huán)境污染；試驗(yàn)中華鱉：本試驗(yàn)中華鱉由溫室養(yǎng)殖至400 g左右，整個(gè)養(yǎng)殖過程避免接觸呋喃西林藥物，進(jìn)入試驗(yàn)池前，活體中華鱉經(jīng)檢測不含SEM。以上試驗(yàn)飼料、水和中華鱉呋喃西林原藥及SEM檢測結(jié)果見表1。

表1 本試驗(yàn)各階段過程中呋喃西林原藥及SEM檢出量Table 1　Nitrofurazoneand SEM amountsin differentperiods μg/kg

1.2. 2試驗(yàn)過程

將中華鱉放入準(zhǔn)備好的甲、乙、丙3個(gè)暫養(yǎng)池中，甲為陽性對照組；乙為非消毒處理組；丙為消毒處理組。每個(gè)試驗(yàn)組放40只400 g大小的中華鱉，做好日常水質(zhì)管理，投喂無藥物殘留的試驗(yàn)飼料，待馴化正常攝食一周后開始按試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)步驟進(jìn)行研究試驗(yàn)。

給甲組配制含有一定濃度的呋喃西林藥餌（2g/kg，10%有效含量），每天按中華鱉體重的1.5%～2.0%作為投喂量投喂藥餌，連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月。乙組投喂不含藥物的試驗(yàn)飼料，并且采取不施加任何消毒劑，連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月，丙組投喂不含藥物的試驗(yàn)飼料，并且采取正常消毒，連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月。

1.3樣品檢測

3個(gè)月飼喂期結(jié)束后，將以上3組試驗(yàn)中華鱉清洗-宰殺-分割成肉、骨頭，并分別凍干、100℃烘干和130℃烘干。將上述凍干、烘干的中華鱉肉、骨用粉碎機(jī)進(jìn)行磨粉，按80目標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過篩，未過篩的重復(fù)再打磨一次。

1.3.1SEM的測定

樣品中SEM分析參考檢測方法[6-7]，具體如下，稱取2 g樣品，加入10mL甲醇溶液（1∶1，體積比），振蕩后4000 r/min離心5min，去上清。往殘留物中加入10mL，0.2mol/L鹽酸，10 000 r/min均質(zhì)1min，依次加入內(nèi)標(biāo)工作液100μL，鄰硝基苯甲醛溶液100μL，混合30 s后振蕩30min，37℃恒溫箱衍生16 h。然后加入適量Na2HPO4溶液混勻后，調(diào)pH至7.4，加入10m L乙酸乙酯，振蕩10min后，10 000 r/min離心10min，收集上清液，重復(fù)提取一次，合并收集液，氮?dú)獯蹈珊螅瑲堅(jiān)?mL 5%乙酸銨甲醇溶液溶解，再加入2mL正己烷，去除上層溶液后過0.22μm濾膜，取10μL供檢測。

色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18，2.1 mm× 100mm，1.7μm，美國Waters公司；流動(dòng)相A（乙腈），流動(dòng)相B（0.1%甲酸溶液）；梯度洗脫0～7min，10%A-90%A；7min～10min，90%A；10min～10.01min，90% A～10%A；10.01min～20min，10%A；流速：200μL/min，柱溫：30℃。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為MRM，定性離子對為209/192、209/ 166，定量離子對為209/166，駐留時(shí)間0.5 s，錐孔電壓25V，碰撞能量8 eV。

1.3.2蛋白質(zhì)的測定

稱取2 g樣品與硫酸、催化劑等共同加熱消化，采用凱氏定氮法測定[8]。

1.3.3數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件進(jìn)行分析，部分結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

2　結(jié)果與討論

2.1不同處理?xiàng)l件下的SEM生成量差異

采用內(nèi)標(biāo)法對不同處理?xiàng)l件下的樣品進(jìn)行SEM定量檢測，結(jié)果如表2所示。

表2不同處理組的SEM殘留檢測Table 2　SEM amountof sam p lesunder differen t treatments μg/kg

呋喃西林代謝物SEM來源極為復(fù)雜，目前已經(jīng)在不同的食品中發(fā)現(xiàn)了SEM，而且來源各異，除了使用呋喃西林藥物導(dǎo)致的代謝物殘留之外，食品包裝、面粉改良劑及食品加工程序都可成為食品中SEM污染的來源[9]。本研究在排除外界人為添加呋喃西林藥物的情況下，仍在中華鱉粉中檢出了SEM，且SEM在肉、骨中的分布與人為添加呋喃西林藥物的殘留分布不一致，表明自然狀態(tài)下，中華鱉粉中SEM的存在與外界呋喃西林藥物污染無關(guān)。

有研究表明，食品加工過程中，經(jīng)次氯酸鹽處理后，會(huì)檢測到氨基脲SEM[5，10]。中華鱉粉在后續(xù)加工過程中均未接觸消毒劑，唯獨(dú)在養(yǎng)殖過程中會(huì)對水體定期使用消毒劑進(jìn)行日常殺菌消毒。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不使用消毒劑組的鱉粉中也檢出了SEM，說明養(yǎng)殖中使用消毒劑與SEM檢出無直接關(guān)系。

根據(jù)本試驗(yàn)，中華鱉粉中呋喃西林代謝物的來源與干燥工藝有關(guān)，且與烘干溫度呈正相關(guān)。100℃烘干溫度下處理的中華鱉，其呋喃西林代謝物檢出為微量的1μg/kg～2μg/kg。據(jù)此推測，該溫度可能是中華鱉粉原料在高溫下發(fā)生化學(xué)變化產(chǎn)生呋喃西林代謝物的臨界溫度。而隨著溫度的升高，呋喃西林代謝物形成也逐漸增多。高溫處理下，骨粉中呋喃西林代謝物的形成明顯高于肉粉，這可能與骨、肉在蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成上的差異密切相關(guān)。

2.2蛋白質(zhì)含量檢測及其與SEM生成量相關(guān)性分析氨基脲為聯(lián)氨類化合物，其來源與樣品中的含氮物質(zhì)密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探究氨基脲的產(chǎn)生來源，用凱氏定氮法對中華鱉肉和鱉骨樣品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，重復(fù)3次取其平均值，結(jié)果如表3所示。

表3　不同處理?xiàng)l件下的中華鱉肉和鱉骨的蛋白含量（n=3）Table3　Protein content ofm eatand boneof turtleunder different treatments（n=3）%

從表3中得知，用不同的干燥條件處理樣品，氨基脲生成量在鱉肉中的含量要高于鱉骨（除130℃烘干條件外），而表3上鱉肉的蛋白質(zhì)含量要顯著高于鱉骨，這表明一般情況下氨基脲生成量與樣品中的蛋白質(zhì)含量存在著很高的關(guān)聯(lián)性，蛋白質(zhì)含量高的鱉肉比其他蛋白含量低的鱉組織更容易產(chǎn)生氨基脲。但對于130℃烘干條件下，鱉骨中產(chǎn)生了比鱉肉中更高的氨基脲生成量，這也證明了氨基脲的生成不僅跟樣品中蛋白質(zhì)含量有關(guān)，還可能與樣品中的其他組分，比如氨基酸組成有關(guān)聯(lián)，謝冬冬等[5]研究發(fā)現(xiàn)，被處理的動(dòng)物組織中的氨基脲含量隨著不同部位中蛋白質(zhì)及氨基酸含量的上升而隨之增加，蛋白質(zhì)含量越多，氨基脲的含量越高，其中精氨酸含量的差異是導(dǎo)致氨基脲生成量差異的主要原因。

3　結(jié)論

外源添加呋喃西林藥物后，制成的中華鱉粉中SEM主要?dú)埩粼谌庵?，肉中殘留濃度是骨中?倍，而非外源添加藥物造成的SEM殘留在肉、骨中含量基本均衡，差異不顯著。

中華鱉在整個(gè)養(yǎng)殖加工過程中僅養(yǎng)殖環(huán)節(jié)會(huì)使用消毒劑，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示養(yǎng)殖過程中使用消毒劑組與不使用消毒劑組均微量檢出SEM，由此推論中華

鱉養(yǎng)殖過程使用消毒劑，與中華鱉粉中SEM的檢出無直接關(guān)系。

凍干處理的中華鱉粉中呋喃西林代謝物檢測呈陰性，而烘干處理的呋喃西林代謝物檢測呈現(xiàn)陽性，且呋喃西林代謝物檢測濃度隨著烘干溫度的升高而升高。此外，在130℃高溫處理下，骨粉中呋喃西林代謝物的形成明顯高于肉粉，這可能與其氨基酸組成差異有關(guān)。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.001

收稿日期：2014-04-14

基金項(xiàng)目：浙江檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（ZK201151）；國家自然科學(xué)基金（31401478）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD29B06）

作者簡介：曹愛玲（1981—），女（漢），獸醫(yī)師，碩士，主要研究動(dòng)物獸藥殘留。

*通信作者

Correlative Analysis on the Occurrence of Sem icarbazide of Pelodiscus Sinensis

CAOAi-ling1，SHENLi1，CAILu-yun2，*，ZHANG Jian-ren3
（1.Xiaoshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 311208，Zhejiang，China；2.College of Food Scienceand Technology，BohaiUniversity；Food Safety Key Lab of Liaoning Province；National&Local JointEngineering Research Centerof Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；3.Hangzhou Xiaoshan Tianfu Bio-tech Co.，LTD，Hangzhou 311208，Zhejiang，China）

Abstract：This paper studied the reason of remains psitire in Pelodiscus Sinensis powder under different treatments.The possible source of SEM was investigated from breeding to processing throughout thewhole chain. The results indicated that the use of disinfectantswas irrelevantwith SEM positive，while high temperature of drying wowld cause SEM positive.The amount of SEM was higher as the drying temperature was higher.The amount of semicarbazide was distinctly different between different tissues，and meatwas higher than bone，except for 130℃drying treatment.Further analysis showed that semicarbazide generation was closely related with protein contentand their composition.

Key words：Pelodiscus sinensis；semicarbazide；disinfectant；protein