徐寧寧，謝琳琳，唐陽，賽明澤，丁德潤

（上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620）

殼聚糖（CTS）是甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，是天然糖類中唯一大量存在的堿性氨基多糖，具有許多特殊的物理與化學(xué)性質(zhì)和生理功能[1-3]，如無毒、生物相容性、組織修復(fù)和減少創(chuàng)面滲出等功能[4-7]，在醫(yī)藥材料、功能材料、藥物釋放等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。由于殼聚糖分子間存在強(qiáng)的分子氫鍵，其化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，使其應(yīng)用受到限制[8-10]。因此，可對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性得到殼聚糖衍生物，改善其物理及化學(xué)性質(zhì)。本文在殼聚糖衍生物上絡(luò)合單質(zhì)碘，利用單質(zhì)碘的廣譜抗菌性，制備新型生物醫(yī)用材料。

殼聚糖與碘分子結(jié)合穩(wěn)定性較差，研究表明在殼聚糖結(jié)構(gòu)單元上引入陽離子結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定結(jié)合碘分子。本工作用雙氰胺對殼聚糖進(jìn)行胍基化改性，得到易溶于水的殼聚糖衍生物——?dú)ぞ厶请p胍鹽酸鹽（CGH）。CGH 中含有多個(gè)氨基，增強(qiáng)了聚陽離子性，其正電荷對體積大、易變形的碘分子有強(qiáng)吸引作用。這種改性殼聚糖的碘絡(luò)合物增強(qiáng)了抑菌效果，是一種高效低毒具有潛在應(yīng)用價(jià)值的生物醫(yī)用 材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖（醫(yī)用級，平均相對分子質(zhì)量為1.32 × 105，脫乙酰度90%），浙江金殼生物化學(xué)有限公司；雙氰胺，化學(xué)純，上海展云化工有限公司；碘，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

AVATAR370 FTIR 型紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet 公司；STA PT-1000 型熱失重分析儀，德國Linseis 公司；D2 PHASER 型X 射線衍射儀，德國布魯克AXS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 CGH 的制備

取4.0g CTS 于250mL 三頸燒瓶中，加入150mL濃度為0.15mol/L 的鹽酸溶液攪拌至CTS 完全溶解。加入3.0g 雙氰胺，90℃攪拌2h，60℃減壓蒸餾得濃縮液，加無水乙醇沉淀，真空抽濾。固體用無水乙醇浸泡洗滌抽濾（反復(fù)3 次），60℃真空干燥6h，得CGH 粉末[11]。反應(yīng)式如式（1）。

1.2.2 CGH-I2的制備

配制 0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L 的碘乙醇液。分別取CGH 1.0g于上述各溶液中，室溫下避光攪拌5h，抽濾，產(chǎn)物用無水乙醇少量多次洗滌，得CGH-I2，分別編號為A、B、C、D、E。

1.2.3 絡(luò)合物中碘含量測定

采用碘量法[12]，定量稱取1.0g 碘絡(luò)合物于碘量瓶中，加入100mL 已標(biāo)定的硫代硫酸鈉溶液，室溫避光攪拌4h。取上層清液用碘量法滴定過量的硫代硫酸鈉。

1.3 性能測試

取CTS、CGH 溴化鉀研磨、壓片，進(jìn)行IR 光譜分析，波數(shù)范圍500～3800cm-1； X 射線衍射儀掃描分析譜圖，掃描范圍5°～80°；熱失重（TG）曲線溫度范圍21～700℃，升溫速率15℃/min。

1.4 抑菌性測試[13]

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液分散到培養(yǎng)基內(nèi)，菌濃約為1.08′105cell/L。取上述溶液30mL稀釋10 倍裝入直徑為12cm 的培養(yǎng)皿中冷卻固化。將CGH 和CGH-I2制成直徑為10mm 的圓片，紫外滅菌30min。分別將圓片貼附于培養(yǎng)皿中不同位置，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況，記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 IR 分析

CTS、CGH 的紅外光譜如圖1 所示。

由圖1 可見，CTS 紅外光譜在3423.19cm-1處為—OH 的伸縮振動(dòng)和—NH2伸縮振動(dòng)吸收峰，表現(xiàn)為一個(gè)強(qiáng)而寬的峰，表明有羥基與氨基間的氫鍵作用；2869.7cm-1處為C—H 伸縮振動(dòng)吸收峰；1081.92cm-1處為糖類結(jié)構(gòu)特征峰[14]；1594.92cm-1處為 N—H 的彎曲振動(dòng)峰。CGH 紅外光譜1637.34cm-1處為[—HN(C=NH)NH2]中C=N 的伸縮振動(dòng)吸收峰[15]；1508.13cm-1處為—NH3+的彎曲振動(dòng)吸收峰；1594.92cm-1處的—NH2振動(dòng)峰消失，在1434.85cm-1處出現(xiàn)新的振動(dòng)峰為C—N—C 的伸縮振動(dòng)峰。以上可推斷—NH2上發(fā)生了胍基化改性。

2.2 XRD 分析

CTS、CGH 的XRD 圖譜如圖2 所示。由圖2 可見，CTS 在2θ = 10.5°和20.0°處有兩個(gè)衍射峰是殼聚糖的兩個(gè)特征衍射峰[16]，20.0°處衍射峰較強(qiáng)，可以看出殼聚糖是一種結(jié)晶性高分子。殼聚糖經(jīng)雙氰胺改性后得CGH 的衍射峰變?nèi)?，這是由于改性后破壞了殼聚糖分子內(nèi)的氫鍵，分子間作用力變?nèi)?，使其結(jié)晶性受到破壞。

圖1 CTS、CGH 的紅外光譜圖

圖2 CTS、CGH 的XRD 圖譜

2.3 TG、DTG 分析

CTS、CGH 的TG、DTG 曲線如圖3、圖4 所示。

由圖3 可見，CTS 的降解分為兩個(gè)階段[17]：第一階段在80℃開始，失重率達(dá)到8%，主要是失去水分子和小分子量的聚合物分解造成的；第二階段失重在250℃開始，失重率達(dá)到40%，主要是由于殼聚糖分子鏈的熱分解等復(fù)雜過程造成的。CGH 的降解也分成兩個(gè)階段，與CTS 不同的是其第二階段失重在200℃開始，且CGH 失重率比CTS 失重率大，這是由于改性后破壞了殼聚糖分子內(nèi)氫鍵使分子間作用力降低，分解溫度下降。

由圖4 可見，CTS、CGH 分別有兩個(gè)熱降解過程，且CTS、CGH 的最大熱分解速率分別出現(xiàn)在311.6℃和230.2℃。

2.4 CGH-I2 中碘含量測定

圖3 CTS、CGH 的TG 曲線

圖4 CTS、CGH 的DTG 曲線

CGH 質(zhì)量保持不變，改變單質(zhì)碘的濃度，制備 出碘濃度不同的絡(luò)合物。采用碘量法與濃度差法，找出CGH 與I2的最大質(zhì)量比。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 CGH 與碘的絡(luò)合物的質(zhì)量比

由表1 可見，CGH 與碘絡(luò)合的最大質(zhì)量比為m(CGH)∶m(I2)=1∶0.46。殼聚糖經(jīng)雙氰胺改性后得到的CGH 中含有大量氨基，增強(qiáng)了聚陽離子性，且胍基質(zhì)子化后得到一個(gè)非常穩(wěn)定的胍離子，能在較大pH 值范圍內(nèi)保持正電性，碘分子的電子云密度大，容易受到正電荷吸引，產(chǎn)生靜電吸引力，故CGH 有較強(qiáng)吸引碘分子的能力。

2.5 抑菌性分析

用抑菌環(huán)法[18]分別測CGH、CGH-I2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑，確定其敏感性。依據(jù)抗菌素敏感度標(biāo)準(zhǔn)，抑菌環(huán)直徑小于10mm 敏感度為耐藥；10～15mm 敏感度為中度敏感；抑菌環(huán)直徑大于15mm 敏感度為高度敏感。CGH、CGH-I2抑菌圖片如圖5、圖6 所示。

由圖5 可見，CGH(a)對大腸桿菌抑菌環(huán)直徑為(6±1)mm，對大腸桿菌敏感度為耐藥。CGH-I2(b)對大腸桿菌抑菌環(huán)直徑為(18±1)mm，對大腸桿菌敏感度為高度敏感。

由圖6 可見，CGH(a)對金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑為(8±1)mm，對金黃色葡萄球菌為耐藥。CGH-I2(b)對金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑為(21±1)mm，對金黃色葡萄球菌敏感度為高度敏感。

圖5 CGH(a)、CGH-I2(b)對大腸桿菌的抑菌性

圖6 CGH(a)、CGH-I2(b)對金黃色葡萄球菌的抑菌性

CGH 通過靜電吸引絡(luò)合廣譜抗菌劑單質(zhì)碘后的CGH-I2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

改性得到了殼聚糖雙胍鹽酸鹽，利用其正電荷對體積大、易變形的碘分子有強(qiáng)吸引作用，得到絡(luò)合碘殼聚糖雙胍鹽酸鹽。XRD 分析表明：CGH 破壞了殼聚糖分子內(nèi)的氫鍵，使其結(jié)晶性受到破壞，導(dǎo)致衍射峰強(qiáng)度減弱。TG、DTG 分析表明：CTS、CGH 的降解分為兩個(gè)階段，且其最大熱分解速率分別出現(xiàn)在311.6℃和230.2℃。碘含量分析表明：當(dāng)?shù)庖掖既芤簼舛葹?.02mol/L 時(shí)，殼聚糖雙胍鹽酸鹽吸附碘量最大，其質(zhì)量比為m ( CGH )∶m ( I2) = 1∶0. 46。通過抑菌試驗(yàn)，證實(shí)絡(luò)合碘殼聚糖雙胍鹽酸鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑分別為(18±1)mm 和(21±1)mm，敏感度均為高度 敏感。

[1] 周景潤，辛梅華，李明春. 殼聚糖季銨鹽的制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展，2008，27（5）：679-686.

[2] 賽明澤，圖布新，唐陽，等. 改性殼聚糖加碘膜的制備與表征[J]. 精細(xì)化工，2014，31（1）：17-20.

[3] Nadia A Mohamed，Riham R Mohamed，Rania S Seoudi. Synthesis and characterization of some novel antimicrobial thiosemicarbazone O-carboxymethyl chitosan derivatives[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，63（2）：163-169.

[4] Wang Qun，Zhang Na，Hu Xianwen，et al. Chitosan / polyethylene glycol blend fibers and their properties for drug controlled release[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2008，85A（4）：881-887.

[5] Zhong Zhimei，Aotegen Bayaer，Xu Hui，et al. The influence of chemical structure on the antimicrobial activities of thiosemicarbazone-chitosan[J]. Cellulose，2014，21（1）：105-114.

[6] Dilamian M，Montazer M，Masoumi J. Antimicrobial electrospun membranes of chitosan/poly(ethylene oxide) incorporating poly(hexamethylene biguanide) hydrochloride[J]. Carbohydrate Polymers，2013，94（1）：364-371.

[7] 祝二斌，辛梅華，李明春，等. 殼聚糖/聚乙烯醇共混膜的氫鍵和相容性[J]. 化工進(jìn)展，2012，31（5）：1082-1087.

[8] Mourya V K，Nazma N Inamdar. Chitosan-modifications and applications ： Opportunities galore[J]. Reactive & Functional Polymers，2008，6（68）：1013-1051.

[9] Dong Anjie，F(xiàn)eng Menghuang，Qi Haiying，et al. Synthesis and properties of O-carboxymethyl chitosan/poly(ethylene glycol) graft copolymers[J]. Journal of Materials Science：Materials in Medicine，2008，2（19）：869-876.

[10] Raafat Dina，Sahl Hans-Georg. Chitosan and its antimicrobial potential——A critical literature survey[J]. Microbial Biotechnology，2009，2（2）：186-201.

[11] 趙雪，喬真真，何瑾馨，等. 殼聚糖雙胍鹽酸鹽對羊毛織物抗菌性能的影響[J]. 毛紡科技，2009，37（10）：23-26.

[12] 丁德潤，薄蘭君，梁愛斌. 殼聚糖及其衍生物與碘的絡(luò)合物的抑菌性質(zhì)研究[J]. 精細(xì)化工，2006，23（9）：903-906.

[13] 丁德潤，司曉偉，姚有紅. 季銨化兩親性殼聚糖衍生物載藥性質(zhì)[J]. 精細(xì)化工，2012，29（6）：549-553.

[14] Sai Mingze，Zhong Shiling，Tang Yang，et al. Research on the preparation and antibacterial properties of 2-N-thiosemicarbazide-6- O-hydroxypropyl chitosan membranes with iodine[J]. Journal of Applied Polymer Science，2014，131 （15），DOI：10.1002/app.40535.

[15] Zhao Xue，He Jinxin，Zhan Yizhen. Synthesis and characterization of chitosan biguanidine hydrochloride under microwave irradiation[J]. Polymer Journal，2009，41（12）：1031-1035.

[16] 鄧俊，李明春，辛梅華，等. a-酮戊二酸修飾殼聚糖微球?qū)εＱ宓鞍椎奈絒J]. 化工進(jìn)展，2008，27（12）：1991-1995.

[17] Hana P?ichystalová，Numan Almonasy，Abdel-Mohsen A M，et al. Synthesis ， characterization and antibacterial activity of new fluorescent chitosan derivatives[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，65（4）：234-240.

[18] Rodríguez-Nú?ez Jesús R，López-Cervantes Jaime，Sánchez- Machado Dalia I，et al. Antimicrobial activity of chitosan-based films against Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Food Science＆Technology，2012，47（10）：2127-2133.