陶蕾，石剛，倪才華

（江南大學化學與材料工程學院，食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

殼聚糖是甲殼素脫乙酰得到的天然聚陽離子多糖，具有生物相容性好、抑菌止血、促進組織再生、細胞黏附性強和可生物降解等優(yōu)點[1]。為了擴大殼聚糖的應用范圍，人們常常通過接枝、交聯(lián)、共混等方法對其改性以滿足應用需求。由于殼聚糖成膜性好，具有抗菌、藥物控釋及促進傷口愈合作用[2]，因而引起人們青睞。例如谷里鵬等[3]以正硅酸四乙酯為交聯(lián)劑，制備殼聚糖分離膜；王軍等[4]利用席夫堿反應制備季銨化殼聚糖-聚乙二醇單甲醚接枝共聚物；Jiang 等[5]采用雙層溶液澆鑄法制備納米羥基磷灰石增強改性的CS/CMC 復合膜；Meng 等[6]采用溶劑揮發(fā)法制備了CS/SA 復合膜，將其用于傷口敷料或藥物釋放領(lǐng)域。

雖然有關(guān)改性殼聚糖薄膜有了一些報道，但是將殼聚糖基薄膜植入人體內(nèi)，起到手術(shù)后防組織粘連作用，尚有許多科學問題沒有解決。一是殼聚糖膜性脆，缺乏一定柔韌性和力學強度；二是殼聚糖膜在體液中溶解和降解過快，易于從傷口部位流失，導致防粘效果降低，因此殼聚糖膜作為體內(nèi)植入材料的應用受到一定限制。為了克服上述缺陷，本工作首先制備了乳酸和蘋果酸的共聚物（PML），然后將該共聚物與殼聚糖復合制成薄膜，利用聚蘋果酸結(jié)構(gòu)單元上的懸掛羧基，通過聚電解質(zhì)之間的相互作用使共聚物與殼聚糖均勻有效復合；共聚物中的聚乳酸結(jié)構(gòu)單元具有疏水性和一定的力學性 能[7]，與殼聚糖性能互補，因而可以改善殼聚糖的結(jié)構(gòu)，增強復合物的柔韌性和力學強度，另外疏水性組分的引入將減緩殼聚糖的降解速度，維持復合膜在傷口部位的穩(wěn)定性，增強防組織粘連效果。通過投料及合成工藝可以調(diào)節(jié)復合物中聚乳酸和聚蘋果酸結(jié)構(gòu)單元的比例，從而達到控制復合膜綜合性能之目的。本工作所用材料全部具有良好的生物相容性和降解性。

1 實驗部分

1.1 主要原料

殼聚糖（CS），脫乙酰度為96.4%，黏均相對分子質(zhì)量（Mv）為5.3×105，青島金湖甲殼制品有限公司；L-蘋果酸（MA），純度95%，重結(jié)晶提純，上海易蒙斯化工科技有限公司；D,L-乳酸（LA），AR，國藥集團化學試劑有限公司；辛酸亞錫，AR，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 乳酸與蘋果酸共聚物的合成

在反應瓶中投入一定比例的MA 與LA，按單體質(zhì)量的0.5%添加辛酸亞錫，加熱到130℃，攪拌并減壓（0.1MPa）反應 24h，制備3 種乳酸/蘋果酸共聚物（PML，表1），用無水乙醇配成0.4%溶液備用。

1.3 殼聚糖與共聚物復合膜（CS-PML）的制備

將CS 溶于1%乙酸中配成0.4%的溶液，按殼聚糖溶液體積的30%分別加入3 種共聚物溶液，磁力攪拌均勻，用0.01%的NaOH 溶液調(diào)節(jié)共混溶液的pH 值至5.0，將鑄膜液倒入到12cm×12cm 的培養(yǎng)皿中，于 60 ℃烘箱中烘干至恒重，得到CS-PML-A、CS-PML-B、CS-PML-C 共3 種復合膜，用同樣方法制備純殼聚糖膜作比較。用CH-1-S 千分手式測厚儀測量膜厚度為(20.0 ± 0.5)μm。

1.4 復合膜的力學性能測試

按照標準GBT 1040.3—2006 將復合膜制成樣條（10mm×150mm），用電子拉力機測試力學性能，條件：25℃，空氣相對濕度RH 50%，拉伸速度5mm/min。

1.5 復合膜的溶脹性

將膜剪成3cm×3cm 的正方形狀，分別浸入20mL pH 值為7.4 的PBS 溶液及生理鹽水中，恒溫37℃振蕩24h 后，用濾紙輕沾表面水分后稱重，測量3 次取平均值。平衡溶脹度SE的計算如式（1）。

式中，W0和W1分別為溶脹前后復合膜的質(zhì) 量，g。

1.6 復合膜的降解行為分析

將膜剪成大小為3cm×3cm 的正方形，烘干稱重，浸入到30mL 模擬體液中，在37℃下恒溫震蕩，每24h 取出樣品，經(jīng)水洗、烘干后稱重，記錄膜片殘留質(zhì)量分數(shù)。

1.7 復合膜的體外細胞毒性

將對數(shù)期生長的 3T3 細胞用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基稀釋成濃度為6×104/mL 的細胞懸浮液，并接種于 96 孔培養(yǎng)板。將 6cm2復合膜樣品（CS-PML-B） 經(jīng)過高溫滅菌后置于1mL 生理鹽水中（37℃）浸提24h，浸提液經(jīng)RPMI-1640 完全培養(yǎng)基稀釋至0.1μL/μL，稀釋后的浸提液作為樣品組。以RPMI-1640 完全培養(yǎng)基為陰性對照組，含0.64%苯酚的RPMI-1640 培養(yǎng)基為陽性對照組，每組5 個平行樣，采用MTT 法進行細胞毒性實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 共聚物PML 的表征

圖1 是MA 與LA 共聚物的核磁圖譜，可以看到：聚蘋果酸結(jié)構(gòu)單元中 CH2和CH 的質(zhì)子峰分別出現(xiàn)在δ 2.7～3.2 和δ 5.4～5.5 處；在聚乳酸結(jié)構(gòu)單元中，CH3和CH 的質(zhì)子峰分別在δ 1.5 左右和δ 5.2處。依據(jù)積分面積計算出聚蘋果酸與聚乳酸的組分比，結(jié)果示于表1。共聚物中LA 結(jié)構(gòu)單元較投料比的組分高，說明LA 在共聚反應中活性較高。

通過差示掃描量熱分析（DSC）發(fā)現(xiàn)：隨著LA組分增加，得到共聚物的Tg提高，這是因為聚乳酸鏈段不含支鏈，較聚蘋果酸容易規(guī)整排列，鏈段運動受阻，因而Tg較高。

2.2 復合膜的紅外光譜

圖1 乳酸/蘋果酸共聚物的1HNMR 圖譜

表1 乳酸/蘋果酸共聚物的合成結(jié)果

圖2 復合膜的全反射紅外光譜圖

圖2 中曲線c、d、e 是殼聚糖與3 種共聚物復合物的紅外光譜圖，可以看到：在1750cm-1處出現(xiàn)聚蘋果酸及聚乳酸中酯鍵的C=O 對稱伸縮振動 峰，而在CS 樣品(a)中沒有此特征峰；圖2 中a 為3337cm-1處CS 分子鏈上O—H 與N—H 伸縮振動形成的強而寬的重疊峰，而在復合膜中，N—H 的特征峰峰形及強度均有所變化，且向低波數(shù)偏移，說明了NH3+與COO-之間形成復合結(jié)構(gòu)。

2.3 復合膜的力學性能

表2 所示是復合膜的物理性質(zhì)測量結(jié)果。可以看出：復合膜較純殼聚糖膜拉伸強度增加，其中復合膜CS-PML-B 獲得最大增加百分數(shù)，為92%，這是因為復合物中兩組分存在離子相互作用，加固了鏈段之間的吸引力。復合膜兩個樣品的斷裂伸長率較純殼聚糖膜也有增加，因為共聚物的主鏈為碳碳鏈，容易發(fā)生構(gòu)象變化，比起殼聚糖的六元環(huán)結(jié)構(gòu)要柔軟，因此增加了復合膜的柔順性，CS-PML-C樣品斷裂伸長率有所下降，這是因為共聚物中聚乳酸含量過高，發(fā)生自身團聚，與殼聚糖離子相互作用不夠所致。

2.4 復合膜的溶脹性及熱性能分析

復合膜溶脹性能的測試結(jié)果見表2。結(jié)果表明：當加入30%的共聚物后，薄膜在0.9%NaCl 溶液中的溶脹度較純殼聚糖薄膜增加很多，這是因為復合后共聚物破壞了殼聚糖的結(jié)晶性，使得水分子容易進入膜內(nèi)部，使溶脹度增大；但是隨著共聚物中疏水組分LA 的增加，復合膜的疏水性增加，溶脹度又下降；受離子強度及pH 值的影響，復合膜在弱堿性PBS 中的溶脹度較其在0.9%NaCl 溶液中的溶脹度小。

表2 殼聚糖/共聚物復合膜的物理性能

在表2 中還看到，隨著共聚物PML 中疏水組分的增加，復合物的熱分解開始溫度依次升高，這可能是因為隨著PLA 鏈段的增加，共聚物的結(jié)構(gòu)規(guī)整，導致熱降解溫度升高。

2.5 復合膜的體外降解

復合膜在模擬體液（SPF）中的降解曲線如圖3所示。純CS 膜有較快的降解速率，7 天后質(zhì)量僅余50%，降解周期短。而復合膜的降解速率較CS 平緩，降解周期得到有效延長，這是由于共聚物中含有一定量疏水性的聚乳酸鏈段，同時殼聚糖與共聚物復合后，聚電解質(zhì)的電荷相互作用形成較多的物理交聯(lián)點，增強了膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此降解時間適當延長，提高了薄膜作為防粘連劑在體內(nèi)應用的有效性。

圖3 復合膜在模擬體液中的降解行為

2.6 復合膜的細胞毒性實驗

圖4 顯示3T3 細胞分別與陽性對照組、陰性對照組、復合膜樣品組（復合膜CS-PML-B 浸提液）相互作用后的顯微鏡照片，可知陽性對照組(a)樣品大部分圓縮死亡，而陰性對照組(b)和復合膜樣品組(c)的細胞形態(tài)正常，貼壁生長良好。用MTT 法測算細胞的相對增值率RGR，復合膜樣品組5 個平行樣品的 RGR 平均值為98.7%，反應等級為1 級，根據(jù)細胞毒性判斷標準，RGR>75% 時為細胞無毒，因此所制備的復合膜無細胞毒性。

3 結(jié) 論

圖4 在不同介質(zhì)中培養(yǎng)的3T3 細胞的顯微鏡照片

用所合成的蘋果酸/乳酸共聚物與殼聚糖復合，成功制備了結(jié)構(gòu)均一、性能改善的復合薄膜，與純 殼聚糖膜相比較，復合膜的拉伸強度最大增加92%， 斷裂伸長率最大增加35 %，降解殘留50%由純殼聚糖膜的7天延長到復合膜的28天；薄膜無細胞毒性，生物相容性好，在醫(yī)療領(lǐng)域作為組織防粘連劑具有應用前景。

符 號 說 明

Mv——黏均分子量

Mn——數(shù)均摩爾質(zhì)量，g/mol

Mw——質(zhì)均摩爾質(zhì)量，g/mol

PDI——分子量分布指數(shù)，量綱為1

Tg——玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，℃

[1] Jayakumar R， Menon D， Manzoor K，et al. Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials——A short review[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：227-232.

[2] Bagheri-Khoulenjani S，aghizadeh S M，Mirzadeh H，et al. An investigation on the short-term biodegradability of chitosan with various molecular weights and degrees of deacetylation[J]. Carbohydrate Polymers， 2009，78（4）：773-778.

[3] 谷里鵬，金志卓. 殼聚糖富氧膜的研究[J]. 化工進展，2009，28（s1）：149-151.

[4] 王軍，李明春，辛梅華，等. N-mPEG-O-季銨化殼聚糖微球的制備及其載藥性能[J]. 化工進展，2013，32（1）：140-144.

[5] Jiang Liuyun，Li Yubao， Xiong Chengdong，et al. A novel composite membrane of chitosan-carboxymethyl cellulose polyelectrolyte complex membrane filled with nano-hydroxyapatite Ⅰ . Preparation and properties[J]. Journal of Membrane Science，2009，20（8）：1645-1652.

[6] Meng Xin，Tian Feng，Yang Jian，et al. Chitosan and alginate polyelectrolyte complex membranes and their properties for wound dressing application[J]. Journal of Membrane Science，2010，21（8）：1751-1759.

[7] 陳衛(wèi)豐，居學成，翟茂林. 完全生物降解聚乳酸共混復合材料的研究進展[J]. 高分子材料科學與工程，2011，27（2）：171-174.