毛揚(yáng)帆，李明春，辛梅華

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門 361021）

自組裝是指由分子之間的非共價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)以及分子形狀自發(fā)識(shí)別而形成超分子結(jié)構(gòu)[1]。自組裝的形成一般由一種作用力為主或幾種作用力共同作用，其中靜電作用較其他二級(jí)作用力更強(qiáng)[2]。殼聚糖及其衍生物常用于具有靜電作用的自組裝中，Wang 等[3]制備了N,N-二甲基-N-十八烷基-賴氨酸改性殼聚糖（OQLCS），分別接枝聚乙二醇單甲醚（mPEG）和葉酸（FA），制得mPEG-OQLCS 和FA-OQLCS，將三者與膽固醇混合利用水化法制得自組裝囊泡，囊泡對(duì)鈣黃綠素具有低滲透率，可應(yīng)用于親水性藥物的包載。Fan 等[4]制備了兩親性的O-羧甲基-N-烷基化殼聚糖，研究了產(chǎn)物與陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴混合體系的自組裝行為，結(jié)果表明，混合體系能自發(fā)形成囊泡，靜電作用和疏水作用是囊泡形成的主要驅(qū)動(dòng)力。Shu 等[5]制備了N-(2-羥基)丙基-3-三甲基殼聚糖季銨鹽與硫酸葡聚糖自組裝納米球，以牛血清蛋白為模型藥物，研究了蛋白質(zhì)藥物在口服給藥領(lǐng)域的應(yīng)用，結(jié)果表明，在酸性條件下其納米球具有緩釋效果。Valente等[6]以殼聚糖和硫酸葡聚糖為原料制備載牛血清蛋白的納米粒，并與間充質(zhì)干細(xì)胞共同封裝至海藻酸鈉納米粒中形成新型雙藥物遞送系統(tǒng)，結(jié)果表明，納米粒通過靜電自組裝，具有粗糙的表面，有利于細(xì)胞遷移和黏附，載藥納米粒50h 的累積釋放率為10%，900h 釋放平衡的累積釋放率為35%左右。Martins 等[7]制備N,N,N-三甲基殼聚糖，與海藻酸鈉復(fù)合制備聚電解質(zhì)復(fù)合物，研究其對(duì)姜黃素的釋放，結(jié)果表明，其在模擬胃液中30h 釋放平衡的累積釋放率為20%。綜上所述，靜電作用對(duì)殼聚糖及其衍生物自組裝行為及藥物釋放行為具有一定的影響，目前靜電作用的自組裝研究主要集中在囊泡、納米粒等方面。在天然高分子共組裝領(lǐng)域，聚陽離子以殼聚糖及季銨化殼聚糖研究較多，聚陰離子則以海藻酸鈉、硫酸葡聚糖研究較多，且研究多為水溶性產(chǎn)物，油溶性產(chǎn)物的共組裝研究鮮有報(bào)道。磺化殼聚糖作為水溶性陰離子殼聚糖衍生物，不僅具有海藻酸鈉、硫酸葡聚糖所具有的生物相容性和生物可降解性，還具有抗病毒性、抗凝血性、抗菌性和成骨活性等優(yōu)點(diǎn)。本文制備了油溶性的O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），合成路線見圖1。考慮雙親分子單分子膜的性質(zhì)在一定條件下可預(yù)測自組裝囊泡的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)[8]，本文研究了HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡的性能，為進(jìn)一步研究其自組裝行為提供依據(jù)。

圖1 殼聚糖衍生物HSDLCS 和QADLCS 的合成路線圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），實(shí)驗(yàn)室自制（殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為500000；HSDLCS 磺化度為21.67%，烷基化度為177.10%；QADLCS 季銨化度23.69%，烷基化度為178.59%。兩個(gè)產(chǎn)物均溶于THF、DMF 和氯仿）[9]；維生素B12，上海國藥集團(tuán)；其他試劑，均為市售分析純。

JML04S 型雙驅(qū)動(dòng)膜天平，上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司；UV-3 系列紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HITACHI S-3500N 掃描電鏡，日本Hitachi 公司；ZEN3600 納米激光粒度及Zeta 電位分析儀，英國malvern 公司。

1.2 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的π-A 等溫線測定

將殼聚糖主鏈相對(duì)分子質(zhì)量為500000 制得的HSDLCS 和QADLCS 分別溶解于氯仿中，于25mL容量瓶中配制成10-3mol/L 的溶液，按帶電基團(tuán)摩爾比1∶1 混合于10mL 容量瓶中。以二次水為亞相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用微量進(jìn)樣器取40μL 樣品溶液，緩慢、均勻地滴加在亞相表面上，待溶液在亞相表面上鋪展并揮發(fā)約30min 后進(jìn)行壓縮，用Wilhelmy 吊片法測定π-A 等溫線。壓膜速率為20mm/min，室溫(20±1)℃， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。配制相同濃度HSDLCS 和QADLCS 溶液，同樣方法測定單組分π-A 等溫線。

1.3 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的制備

0.1g 摩爾比為1∶1 的HSDLCS 和QADLCS 溶解于24mL 氯仿中，加入8mL 濃度為4mg/mL 的維生素B12溶液，冰浴超聲30min 形成W/O 乳液，低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膠狀半固體，放置過夜除氯仿。在冰浴下強(qiáng)力超聲10min，冷凍離心40min，分離載藥囊泡和未包封的藥物。同樣方法制備QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡及空白囊泡。

1.4 囊泡的粒徑和Zeta 電位測定

將 1.3 節(jié)制得的 QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡制成囊泡-水懸混液，采用納米激光粒度及Zeta 電位分析儀在25℃下測定空白囊泡的粒徑分布及Zeta 電位。

1.5 自組裝囊泡的載藥性能和藥物釋放行為

將載藥囊泡放入透析袋并置于25mL 純水中，間隔1h 取出3mL 透析液，再補(bǔ)充3mL 蒸餾水。透析液在UV361nm 測定吸光值，根據(jù)B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物釋放量（ C=0.05829A-0.00036 ，r=0.9995，線性范圍5.36×10-3～5.36×10-2mg/mL），繪制載藥囊泡釋放曲線。由公式包封率=(M1＋M2)/M×100%和載藥量=(M1＋M2)/M3（其中M1、M2、M3和M 分別為釋藥平衡時(shí)藥物總釋放量、未釋放藥物的質(zhì)量、囊材的質(zhì)量和總投藥量；M2是由乙醇破壞囊泡后離心得到的上清液，采用UV 測定吸光值并由B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到），計(jì)算包封率和載藥量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜性質(zhì)

2.1.1 混合單分子膜的π-A 等溫線

按照實(shí)驗(yàn)部分1.2 的操作測得產(chǎn)物單分子膜的π-A 等溫線如圖2 所示，a、b、c 分別為O-磺化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）、O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS）及HSDLCS/QADLCS混合單分子膜的π-A 曲線。由圖2 可見，HSDLCS、QADLCS 及混合單分子膜的π-A 等溫線都較為平滑，無明顯的液態(tài)擴(kuò)張相-液態(tài)凝聚相（LE-LC）轉(zhuǎn)變，崩潰壓均在35mN/m 以上，說明三者均可在水面上形成穩(wěn)定的單分子膜。從π-A 曲線得到相應(yīng)的崩潰壓和極限分子面積見表1。由圖2 和表1 可以看出，HSDLCS 的分子極限面積較QADLCS 低，這是因?yàn)榕c HSDLCS 的磺酸鹽基團(tuán)相比較，QADLCS 的季銨鹽基團(tuán)空間阻礙作用較大，且基團(tuán)間存在靜電作用及水化層[10]，從而影響了單分子膜分子間距離，導(dǎo)致QADLCS 的分子平均占有面積增大，所成的單分子膜較為擴(kuò)張。與單組分產(chǎn)物相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的崩潰壓（46.14mN/m）和極限分子面積較大，這可能是因?yàn)槎咴谛纬蓡畏肿幽r(shí)，親水基團(tuán)進(jìn)入水相中，基團(tuán)之間易形成靜電相互作用，使膜壓縮至崩潰時(shí)需要的壓力更大，故崩潰壓更大。但季銨鹽陽離子周圍有3 個(gè)甲基的屏蔽，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近，使得分子的平均占有面積更大，形成的單分子膜較為擴(kuò)張[11]。

圖2 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的π-A 等溫線 （1?2=10-20m2）

表1 HSDLCS、QADLCS 及其復(fù)合單分子膜的崩潰壓、極限分子面積和最大壓縮模量

2.1.2 混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

2.2 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的性質(zhì)

2.2.1 自組裝囊泡的SEM 圖

圖3 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

按照實(shí)驗(yàn)部分1.3 節(jié)的方法制備HSDLCS/ QADLCS 復(fù)合囊泡。囊泡的SEM 圖如圖4 所示，可見，復(fù)合自組裝形成的囊泡接近于球形，粒徑在200～400nm。

圖4 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合自組裝囊泡的SEM 圖

2.2.2 囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

按照實(shí)驗(yàn)部分1.4 節(jié)的操作測得囊泡的粒徑分布及Zeta 電位見表2。QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡的Zeta 電位分別為49.4mV、-42.4mV 和-6.94mV，單組分囊泡的Zeta電位絕對(duì)值均大于 30mV，說明 QADLCS 和HSDLCS 自組裝囊泡能夠穩(wěn)定存在。 而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的Zeta 電位較小，說明復(fù)合囊泡進(jìn)行自組裝時(shí)HSDLCS 的—SO3-基團(tuán)與QADLCS 的—N(CH3)3+基團(tuán)間存在靜電作用[12]，二者按比例復(fù)合后Zeta 電位不為0，則因?yàn)閮烧呔筛呦鄬?duì)分子質(zhì)量殼聚糖制備而成，長鏈分子本身容易形成纏結(jié)和嵌套等結(jié)構(gòu)，在空間位阻效應(yīng)、靜電作用及疏水作用的共同作用下，HSDLCS 分子鏈上的負(fù)電荷未能完全與QADLCS 分子鏈中的正電荷靜電結(jié)合，導(dǎo)致兩者形成囊泡時(shí)的電位不符合兩者完全復(fù)合的化學(xué)計(jì)量比[13]。

由表2 可以看出，QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡粒徑分別為345.6nm、344.3nm 和 359.9nm，比SEM 中粒徑略大。HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的粒徑較單組分囊泡略大，這可能是因?yàn)榧句@鹽基團(tuán)為正四面體結(jié)構(gòu)，空間位阻較大，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近[11]。3 種囊泡的多分散系數(shù)均在0.1～0.2，說明囊泡的粒徑比較均勻，具有單分散性。

表2 自組裝囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

2.2.3 囊泡的載藥性能及釋放行為

以維生素B12為模型藥物，按照實(shí)驗(yàn)部分1.3節(jié)的方法制備載藥囊泡，測得載藥量和包封率如表3 所示，與單組分囊泡相比，復(fù)合囊泡的載藥量和包封率較高。

表3 HSDLCS、QADLCS 及其復(fù)合囊泡的載藥量和包封率

載藥囊泡的釋放行為見圖5，a、b、c 分別為QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡以及 HSDLCS/ QADLCS 復(fù)合載藥囊泡的釋放曲線?？梢?，3 種囊泡均有緩釋作用，在30h 左右達(dá)到釋藥平衡，其平衡釋放率分別為42.14%、38.16%和23.68%，藥物釋放速率和平衡釋放量順序?yàn)镼ADLCS＞HSDLCS＞HSDLCS/QADLCS 載藥囊泡，說明三者中復(fù)合囊泡的通透性最低，膜結(jié)構(gòu)較為緊密，這與單分子膜結(jié)果一致。與HSDLCS 結(jié)構(gòu)中的磺酸鹽基團(tuán)相比，季銨鹽基團(tuán)由于空間占有較大且基團(tuán)間存在一定的靜電排斥作用，使得QADLCS 囊泡結(jié)構(gòu)較為疏 松[14]。而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡由于正、負(fù)離子極性頭基之間存在強(qiáng)烈的靜電作用，容易形成離子對(duì)結(jié)構(gòu)[4]，在靜電作用和疏水作用的共同驅(qū)動(dòng)下，復(fù)合囊泡具有更有序的結(jié)構(gòu)，藥物通透性降低。

圖5 自組裝囊泡的藥物釋放曲線

2.3 囊泡性質(zhì)與相應(yīng)單分子膜性質(zhì)的關(guān)系

囊泡的釋放行為取決于囊泡分子膜的藥物通透性，而單分子膜的最大壓縮模量可以在一定程度上反映囊泡膜結(jié)構(gòu)的緊密程度，通過對(duì)兩者關(guān)系的考察可以建立單分子膜與相應(yīng)自組裝囊泡性質(zhì)間的聯(lián)系[8，15]，為進(jìn)一步研究產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、單分子膜、囊泡三者之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。殼聚糖衍生物QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 單分子膜的最大壓縮模量與其相應(yīng)自組裝載藥囊泡藥物平衡釋放率關(guān)系如圖6 所示。從圖6 中可以看出，隨著產(chǎn)物單分子膜最大壓縮模量的增加，其相對(duì)應(yīng)自組裝載藥囊泡的藥物平衡釋放率降低，并呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，說明殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)不同會(huì)導(dǎo)致單分子膜性質(zhì)及囊泡性質(zhì)的改變，通過產(chǎn)物單分子膜的最大壓縮模量能在一定程度上對(duì)囊泡結(jié)構(gòu)緊密程度進(jìn)行預(yù)測。

圖6 產(chǎn)物單分子膜性質(zhì)與相應(yīng)自組裝囊泡性質(zhì)之間的關(guān)系

3 結(jié) 論

制得 O- 磺化-N,N- 雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS），研究HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡性質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果表明，與單組分產(chǎn)物單分子膜性質(zhì)相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜具有較大的崩潰壓和壓縮模量；自組裝囊泡HSDLCS 和QADLCS 的Zeta 電位絕對(duì)值大于30mV，能夠穩(wěn)定存在，而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的Zeta 電位較低；HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡具有較高的載藥量和包封率，較低的藥物釋放率和平衡釋放量。3 種單分子膜的最大壓縮模量與其相應(yīng)載藥囊泡藥物平衡釋放率呈一定的線性關(guān)系。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究HSDLCS/QADLCS 混合自組裝行為提供依據(jù)。

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