丁 媛，吳秀娟，康曉靜，普雄明

本研究創(chuàng)新點:

國內(nèi)外現(xiàn)還未有關(guān)于miR-181b-5p與卡波西肉瘤發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究。本研究通過研究miR-181b-5p在人卡波西肉瘤組織中的表達(dá)變化及其臨床意義，為本病的基因診斷及藥物靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)，也對miR-181b-5p在卡波西肉瘤中發(fā)病機(jī)制的深入研究具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度為18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后通過與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解mRNA，發(fā)揮對約30%人類蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名超過9 500個miRNA，分別參與了細(xì)胞的生長、分化和細(xì)胞周期調(diào)控等多個環(huán)節(jié)，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、病毒學(xué)以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)有了許多成熟的研究［1］。雖然卡波西肉瘤 (Kaposi's sarcoma，KS)組織來源不清，但大多數(shù)研究結(jié)果還是認(rèn)為，KS細(xì)胞主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞，腫瘤組織中可能還存在某種必要的細(xì)胞產(chǎn)物以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長［2］。而有研究表明，miR-181b通過調(diào)控核因子κB(NF-κB)信號通路作用于靶基因核蛋白α3［3］，最終參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的過程。miR-181b-5p是從miR-181b的前體5'端加工而來。miR-181b-5p是否通過復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，還有待于進(jìn)一步驗證。本研究檢測miR-181b-5p在人KS組織中的表達(dá)，明確miR-181b-5p是否與KS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集2012年1月—2013年10月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院18例行HE染色且病理檢查明確診斷KS患者的KS組織及癌旁組織 (活檢取材)，存于液氮罐中。

1.2 主要試劑 miRNeasy Mini Kit試劑盒 (德國Qiagen公司)，Trizol試劑 (美國Invitrogen公司)，RNA酶抑制劑、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 (美國Epicentre公司)，10×反轉(zhuǎn)錄 (RT)緩沖液、2×PCR Master Mix(美國Super Array公司)，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合液 (芬蘭HyTest Ltd公司)，RT引物 (上海英駿生物技術(shù)有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 提取組織總RNA(含miRNA) 取液氮保存的KS組織及癌旁組織 (50 mg)，按miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取總RNA。采用紫外線吸收法檢測RNA的濃度及純度，OD260/OD280比值在1.8～2.2之間的用于下一步實驗。

1.3.2 RT-RNA 選取 2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μl、10 × RT 緩沖液 2 μl、RT 引物 (1 μmol/L)0.3 μl、總RNA 700 ng、MMLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 (200 U/μl)0.2 μl、RNA 酶抑制劑 (40 U/μl)0.3 μl，加去 RNA 酶水至20 μl，制成RT混合反應(yīng)液。采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RT-RNA:16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min，合成的cDNA用于實時熒光定量PCR檢測。RT引物:hsa-miR-181b:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCACCG -3';U6:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 實時熒光定量PCR檢測使用ViiA 7 Real-time PCR系統(tǒng)，實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:2 × PCR Master Mix 5 μl、10 μmol/L PCR 特異引物:上游引物 0.5 μl、下游引物 0.5 μl，加水至總體積為8 μl，輕彈管底將溶液混合，以5 000 r/min離心1 min(離心半徑10 cm)。將8 μl混合液加到384孔PCR板對應(yīng)孔中，再加入對應(yīng)的cDNA 2 μl，小心粘上Sealing Film封口膜，并以5 000 r/min離心1 min(離心半徑10 cm)。U6和各樣品的目的miRNA均按以下程序進(jìn)行:95℃ 10 min，共40個 PCR循環(huán)〔95℃ 10 s，60℃ 60 s(收集熒光)〕。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進(jìn)行，升溫速率為0.05℃/s)，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。得到基本循環(huán)數(shù) (Ct)值，以U6為內(nèi)參，△Ct=Ct與內(nèi)參循環(huán)數(shù)差值，△△Ct=最低樣本△Ct值 -其他各樣本△Ct值，目的基因相對含量=2-△△Ct。hsa-miR-181b-5p PCR 特異引物的上游引物為:5'-GGGAACATTCATTGCTG-3'，下游引物為:5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'。U6 PCR特異引物的上游引物為:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物為:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.4 分類標(biāo)準(zhǔn) KS組織病理分期［4］:(1)斑片期:無增生的梭形細(xì)胞和血管成分，真皮內(nèi)血管增生擴(kuò)張，傾向于形成新生血管，非特異性改變;(2)斑塊期:少量血管成分，梭形細(xì)胞逐漸增多;(3)結(jié)節(jié)期:梭形細(xì)胞明顯密集。全身皮損類型［5］:斑片、斑塊、結(jié)節(jié)、糜爛、水腫。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 患者均為維吾爾族，其中男17例，女1例;年齡29～79歲，平均 (60.0±14.1)歲;病程1～132個月，平均 (24.2±33.8)個月;KS組織病理分期:斑片期5例，斑塊期5例，結(jié)節(jié)期8例;全身皮損面積:≤1%6例，＞1%12例;全身皮損類型≤2種7例，＞2種11例;人皰疹病毒8型 (HHV-8)陽性15例，陰性3例;人類免疫缺陷病毒 (HIV)陽性7例，陰性11例;HIV合并HHV-8雙陽性6例，雙陰性2例。

2.2 KS組織和癌旁組織中miR-181b-5p表達(dá)水平KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.73 ±0.40)，癌旁組織中miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.24±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=4.826，P＜0.01)。

2.3 miR-181b-5p表達(dá)水平的單因素分析 不同年齡、病程、全身皮損面積、全身皮損類型及HHV-8、HIV陰陽性患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。不同腫瘤組織病理分期患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);斑塊期、結(jié)節(jié)期患者miR-181b-5p表達(dá)水平高于斑片期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。HIV合并HHV-8雙陽性患者miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.32 ±0.19)，HIV 合并HHV-8雙陰性患者miR-181b-5p表達(dá)水平為 (0.43±0.17)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=1.615，P=0.158)。

3 討論

由于獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS)合并KS病死率高，且KS可以幫助早期診斷AIDS以及評估預(yù)后［6］，故其在AIDS的防治工作中發(fā)揮著巨大作用。現(xiàn)已證明，miR-181b在炎癥和惡性腫瘤中形成并建立了廣泛的聯(lián)系，miR-181b上游被STAT3和HMGA1轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)，其中STAT3通過白介素6(IL-6)激活的轉(zhuǎn)錄因子直接激活miR-181b，從而抑制腫瘤抑制基因PTEN和CYLD的功能，導(dǎo)致NF-κB活性增強(qiáng)后造成炎癥的發(fā)生，而miR-181b通過抑制下游靶基因CBX7參與調(diào)控細(xì)胞周期，通過P27、BCL2等靶基因影響腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和凋亡［7］;近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用［8］。研究顯示，miR-181b表達(dá)水平在結(jié)腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、甲狀腺癌、口腔癌、骨肉瘤、急性髓細(xì)胞性白血病、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中上調(diào)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、胃癌、肺癌、前列腺癌中下調(diào)［8］，以上結(jié)果均提示miR-181b的功能較為獨特，其表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)取決于腫瘤的類型和與之對立的細(xì)胞種類;miR-181b還參與了各種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動［8］。國內(nèi)、外少見KS與人miRNA的報道，本研究通過實時熒光定量PCR檢測KS組織中miR-181b-5p的 表 達(dá) 水 平，結(jié) 果 顯 示，miR-181b-5p在KS組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，表明其與KS的發(fā)生發(fā)展可能存在著密切關(guān)系，提示miR-181b-5p對于KS來說可能是一種致瘤基因。

表1 miRNA-181b-5p表達(dá)的影響因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

表1 miRNA-181b-5p表達(dá)的影響因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

注:*為F值;與斑片期比較，△P＜0.05;HHV-8=人皰疹病毒8型，HIV=人類免疫缺陷病毒

因素 例數(shù) miRNA-181b-5p表達(dá)水平 t(F)值 P值年齡(歲)11 0.83 ±0.40 1.739 0.101≥60 10 0.59 ±0.39＜60 8 0.91 ±0.37病程(月) 0.816 0.427≤6 6 0.84 ±0.44＞6 12 0.68 ±0.39腫瘤組織病理分期 4.181* 0.036斑片期 5 0.37 ±0.22斑塊期 5 0.96 ±0.40△結(jié)節(jié)期 8 0.82 ±0.37△全身皮損面積(%) 0.504 0.621≤1 6 0.80 ±0.42＞1 12 0.70 ±0.41全身皮損類型(種) 0.425 0.677≤2 7 0.78 ±0.43＞2 11 0.70 ±0.41 HHV-8 1.392 0.183陽性 15 0.41 ±0.11陰性 3 0.25 ±0.14 HIV 0.834 0.416陽性 7 0.67 ±0.41陰性

本研究結(jié)果顯示，不同年齡、病程、全身皮損面積、全身皮損類型及HHV-8、HIV陰陽性患者KS組織中miR-181b-5p表達(dá)水平無差異。有研究報道，HHV-8和HIV雙重感染可增加KS的發(fā)生率，雙重感染患者病死率較單純感染患者明顯提高［9］，提示雙重感染患者病情可能較重，miRNA-181b-5p在腫瘤組織中高表達(dá)。而本研究結(jié)果顯示，HIV合并HHV-8雙陽性患者miR-181b-5p表達(dá)水平與HIV合并HHV-8雙陰性患者無差異，可能和本研究臨床病例數(shù)較少有關(guān)。

Lu等［10］認(rèn)為，miRNA表達(dá)譜可以作為腫瘤組織分型的依據(jù)，還可以作為細(xì)胞分化程度的客觀評價，從而得出miRNA可能參與了細(xì)胞分化狀態(tài)的結(jié)論。通過對腫瘤組織和正常組織間細(xì)胞分化程度的對比，建立與之對應(yīng)的腫瘤miRNA標(biāo)簽或miRNA表達(dá)譜，對于腫瘤的早期診斷和靶向治療有積極推動作用。Heffelfinger等［11］發(fā)現(xiàn)，通過miRNA的表達(dá)水平可以對8例浸潤型基底細(xì)胞癌患者中的7例進(jìn)行準(zhǔn)確分類，沒有準(zhǔn)確分型的1例患者為混合型基底細(xì)胞癌。尤其是miR-183的表達(dá)水平在浸潤型基底細(xì)胞癌中明顯低于結(jié)節(jié)型基底細(xì)胞癌，進(jìn)一步證明其可抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。Santucci等［12］認(rèn)為，KS和其他皮膚腫瘤 (如蕈樣肉芽腫)一樣，分為斑片期、斑塊期和結(jié)節(jié)期，臨床上表現(xiàn)為一個連續(xù)發(fā)展的過程。在組織學(xué)上亦是如此，斑片期組織學(xué)以非特異性炎癥為主，而斑塊期和結(jié)節(jié)期則以增生的梭形細(xì)胞和血管瘤樣結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為主。本研究中，雖然斑塊期、結(jié)節(jié)期患者KS組織miR-181b-5p表達(dá)水平均高于斑片期，提示miR-181b-5p可能促進(jìn)腫瘤的生長;但結(jié)節(jié)期與斑塊期無差異，考慮和本研究病例數(shù)較少有關(guān)，也可能與miRNA-181b-5p不能完全體現(xiàn)KS譜性改變有關(guān)，故需要進(jìn)一步增加病例數(shù)后驗證。

KS發(fā)病率相對較低，故本研究納入病例數(shù)較少，而且研究較為局限，未進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞學(xué)功能以及靶基因的深入研究，本研究組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證其是否可以完全體現(xiàn)KS的譜性改變，并進(jìn)行靶基因預(yù)測，進(jìn)而驗證其靶基因的功能，從而為臨床的診斷提供幫助，為探索KS特異性診斷和治療的新方法提供理論依據(jù)。

綜上所述，miRNA-181b-5p在KS組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且在斑片期損害中相對表達(dá)水平較低，表明其與KS的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系，miRNA-181b-5p有可能成為潛在的分子診斷及治療指標(biāo)之一。

［1］ Macfarlane LA，Murphy PR.MicroRNA:biogenesis，function and role in cancer［J］.Curr Genomics，2010，11(7):537-561.

［2］ Gessain A，Duprez R.Spindle cells and their role in Kaposi's sarcoma［J］.Int J Biochem Cell Biol，2005，37(12):2457-2465.

［3］ Sun X，He S，Wara AK，et al.Systemic delivery of microRNA-181b inhibits nuclear factor- κB activation，vascular inflammation，and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Circ Res，2014，114(1):32-40.

［4］ Xu YM，Pu XM，Li F，et al.Clinical and pathological profiles of 43 cases of Kaposi's sarcoma in Xinjiang Uygur Autonomous Region［J］.China Journal of Leprosy Skin Diseases，2005，21(9):685-687.(in Chinese)

徐益明，普雄明，李鋒，等.新疆kaposi肉瘤43例臨床及病理學(xué)分析［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2005，21(9):685-687.

［5］ Wu XJ，Pu XM，Kang XJ，et al.One hundred and five Kaposi sarcoma patients:a clinical study in Xinjiang，Northwest of China［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2014，28(11):1545-1552.

［6］ Moskowitz L，Hensley GT，Chan JC，et al.Immediate causes of death in acquired immunodeficiency sydrome ［J］.Arch Pathol Lab Med，1985，109(8):735-738.

［7］ Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer ［J］.Mol Cell，2010，39(4):493-506.

［8］ Liu J，Shi W，Wu C，et al.miR-181b as a key regulator of the oncogenic process and its clinical implications in cancer(review)［J］.Biomed Rep，2014，2(1):7-11.

［9］ Yang PR，Guo SX，Tan XH，et al.Research on co-infections of HIV and human herpesvirus-8 among the Uygur high-risk groups in a city，Xinjiang ［J］.Chinese Journal of Preventive Medicine，2009，43(11):960-964.(in Chinese)

楊培榮，郭淑霞，譚曉華，等.新疆某市維吾爾族人類免疫缺陷病毒感染高危人群共感染人皰疹病毒8型的調(diào)查［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，43(11):960-964.

［10］ Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435(7043):834-838.

［11］ Heffelfinger C，Ouyang Z，Engberg A，et al.Correlation of global microRNA expression with basal cell carcinoma subtype［J］.G3(Bethesda)，2012，2(2):279-286.

［12］ SantucciM， PimpinelliN， MorettiS， etal.Classic and immunodeficiency - associated Kaposi's sarcoma.Clinical，histologic，and immunologic correlations［J］.Arch Pathol Lab Med，1988，112(12):1214-1220.