王紅清，徐佩茹，李 敏，劉新彩，周廣花

肥胖是引發(fā)機體發(fā)生高血壓、心腦血管疾病、糖尿病等多種慢性疾病的主要誘因［1］，尤其是兒童時期的肥胖很有可能延續(xù)至成人階段，而且始于兒童時期的肥胖比成人后肥胖的人群更易患各種慢性疾?。?-3］。因此，兒童肥胖已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點。目前多項研究顯示，維生素D水平與肥胖顯著相關(guān)［4-6］。但關(guān)于維生素D受體 (VDR)基因多態(tài)性與肥胖的關(guān)系國內(nèi)外研究甚少且結(jié)論不一致。本研究對新疆伊犁地區(qū)漢族和哈薩克族學(xué)齡兒童VDR基因ApaⅠ(A/C)(rs7975232)、BsmⅠ (C/T)(rs1544410)位點多態(tài)性進行分析，旨在探討VDR基因ApaⅠ、BsmⅠ位點多態(tài)性與漢族、哈薩克族學(xué)齡兒童超重/肥胖的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年5—6月在新疆伊犁哈薩克自治州各縣、市、鄉(xiāng)采用整群抽樣的方法，抽取8所小學(xué)中7～12歲超重/肥胖學(xué)齡兒童250例為病例組，其中漢族127例 (女47例，男80例)，哈薩克族123例 (女48例，男75例);選取同時期年齡、性別與病例組匹配的非超重/肥胖健康學(xué)齡兒童255例為對照組，其中漢族131例 (女44例，男87例)，哈薩克族124例 (女52例，男72例)。兩組均排除由代謝、內(nèi)分泌、遺傳及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病所致肥胖及肥胖綜合征。家屬均簽署知情同意書，本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準。采用體質(zhì)量低于同年齡、同性別的第85百分位為健康學(xué)齡兒童，超過同年齡、同性別的第85百分位為超重/肥胖學(xué)齡兒童［7］。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 按經(jīng)典酚-氯仿-異戊醇法從血白細胞中提取基因組DNA，用可見紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度和純度，置-20℃冰箱冷凍保存，用作PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 (1)ApaⅠ位點上游引物:5'-AAGGAGAGGCAGCGGTACT-3'，下游引物:5'-CCGGTCAGTCATAGAGG-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕;(2)BsmⅠ位點:參照文獻 ［8］，上游引物:5'-CAACAAAGACTACAAGTACCGCGTCAGT GA-3'，下游引物:5'-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGG G-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕。

1.2.3 PCR 反應(yīng) PCR 25 μl反應(yīng)體系:模板 DNA 3 μl，重 蒸 水 (ddH2O)8.5 μl，2 × Apa Master MIX 12.5 μl〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕，上游引物與下游引物各0.5 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)〔95℃變性 30 s，62℃退火(ApaⅠ)、56℃退火 (BsmⅠ)30 s，72℃延伸1 min〕，72℃延伸5 min后，用PCR擴增儀擴增，PCR片段長度為329 bp(ApaⅠ)、822 bp(BsmⅠ)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)由 1.5%(ApaⅠ)、1.0%(BsmⅠ)瓊脂糖凝膠電泳，100 V恒壓電泳25 min，利用紫外線凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果并照相記錄。

1.2.4 酶切 取 PCR產(chǎn)物5 μl，加入限制性內(nèi)切酶0.5 μl(Thermo 公 司)、10 × 緩 沖 液 2 μl，ddH2O 8.5 μl，混勻后置65 ℃酶解 30 min(ApaⅠ)、37 ℃酶解過夜 (BsmⅠ)。反應(yīng)產(chǎn)物以PCR Markers〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕作為DNA片段的標準對照物，PCR 酶 解 產(chǎn) 物 由 2.0% (ApaⅠ)、1.5%(BsmⅠ)瓊脂糖凝膠，溴化乙啶染色，于100 V恒壓電泳25 min，利用紫外線凝膠成像系統(tǒng)檢測并照相記錄，判讀基因型。

1.2.5 基因型判定 ApaⅠ位點:純合子基因型 (aa)出現(xiàn)88 bp、241 bp 2條帶，雜合子基因型 (Aa)出現(xiàn)329 bp、241 bp、88 bp 3條帶，純合子基因型 (AA)僅出現(xiàn)329 bp 1條帶 (見圖1);BsmⅠ位點:純合子基因型 (bb)出現(xiàn)646 bp、176 bp 2條帶，雜合子基因型(Bb)出現(xiàn)822 bp、646 bp、176 bp 3條帶，純合子基因型 (BB)僅出現(xiàn)822 bp 1條帶 (見圖2)。

1.2.6 基因測序 選取部分標本的PCR產(chǎn)物送至華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，進一步驗證擴增目的片段酶切后的分型是否正確，部分測序結(jié)果見圖3、4。

1.3 質(zhì)量控制 調(diào)查人員均為兒科專業(yè)，經(jīng)過培訓(xùn)和上崗考核，調(diào)查儀器均經(jīng)過校正;隨機抽取10%的樣本，重復(fù)檢測基因型;選取部分標本的PCR產(chǎn)物進行測序，驗證擴增目的片段酶切后的分型是否正確。

圖1 ApaⅠ位點多態(tài)性電泳圖Figure 1 Electrophoretogram for ApaⅠpolymorphism

本研究創(chuàng)新點:

多項研究結(jié)果表明，新疆哈薩克族人群是肥胖的高發(fā)人群，推測認為可能與特定的遺傳因素相關(guān)。本研究以新疆伊犁地區(qū)7～12歲漢族和哈薩克族學(xué)齡兒童為研究對象，采用病例對照研究方法，運用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測漢族、哈薩克族學(xué)齡兒童維生素D受體 (VDR)基因ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布情況及等位基因頻率，并比較兩民族ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率的差異，不僅豐富了不同民族VDR基因的遺傳學(xué)資源庫，而且判別了VDR基因是否是漢族、哈薩克族學(xué)齡兒童新的肥胖易患基因。從基因?qū)W方面對漢族、哈薩克族超重/肥胖學(xué)齡兒童進行研究，可明確兩族肥胖遺傳因素是否存在異質(zhì)性，且對兩族兒童肥胖的易患性起到預(yù)示作用，進而為兩族兒童肥胖的防治提供分子遺傳學(xué)線索，具有積極的促進作用。

圖2 BsmⅠ位點多態(tài)性電泳圖Figure 2 Electrophoretogram for BsmⅠpolymorphism

圖3 Aa基因型測序圖Figure 3 Sequencing diagram of the Aa genotype

圖4 Bb基因型測序圖Figure 4 Sequencing diagram of the Bb genotype

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用χ2檢驗;兩組民族、性別構(gòu)成及基因型分布、等位基因頻率比較采用χ2檢驗;計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 對照組與病例組漢族和哈薩克族兒童性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 對照組與病例組兒童一般資料比較Table 1 Comparison of general characteristics between control group and case group

2.3 漢族與哈薩克族健康學(xué)齡兒童ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較 漢族與哈薩克族健康學(xué)齡兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

漢族與哈薩克族健康學(xué)齡兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表 3)。

2.4 對照組與病例組兒童ApaⅠ、BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較 對照組與病例組漢族兒童ApaⅠ位點基因型分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);對照組與病例組哈薩克族兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表 4)。

對照組與病例組漢族及哈薩克族兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，見表5)。

2.5 對照組與病例組漢族及哈薩克族兒童兩位點突變情況比較 對照組與病例組漢族兒童兩位點突變情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=3.73，P=0.15，見表6);對照組與病例組哈薩克族兒童兩位點突變情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.29，P=0.96，見表7)。

表2 漢族與哈薩克族健康學(xué)齡兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表3 漢族與哈薩克族健康學(xué)齡兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 3 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表4 對照組與病例組兒童ApaⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 4 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表5 對照組與病例組兒童BsmⅠ位點基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 5 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表6 對照組與病例組漢族兒童兩位點突變情況比較 (例)Table 6 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Han children between control group and case group

表7 對照組與病例組哈薩克族兒童兩位點突變情況比較 (例)Table 7 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Kazakh children between control group and case group

3 討論

Wong等［9-10］通過敲除VDR基因野生型小鼠，結(jié)果顯示，基因敲除小鼠的耗氧量和CO2產(chǎn)生量均明顯高于野生型小鼠，體內(nèi)能量消耗減少，誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，VDR通過調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白 (UCP)的表達來抑制前脂肪細胞分化為脂肪細胞，可減少脂肪的生成，從而抑制肥胖的發(fā)生［11］。但目前關(guān)于人類VDR基因與肥胖易患性的研究較少，且在不同的人群研究中尚未得出統(tǒng)一的結(jié)論。Vimaleswaran等［12］通過研究5 224例45歲英國人群BMI與VDR間的關(guān)聯(lián)性，共選取VDR的26個單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)，結(jié)果提示，VDR基因不太可能是引起英國成人肥胖發(fā)生的主要基因。但對同樣屬于歐洲的法國人來說，TaqⅠ位點的TT基因型和BsmⅠ位點的bb基因型與其他基因型人群相比，BMI增加了4 kg/m2(或體質(zhì)量增加了9 kg)，使肥胖發(fā)生率增加了30%［13］。波蘭學(xué)者以351例50～60歲絕經(jīng)后健康婦女為研究對象，結(jié)果顯示，BsmⅠ位點與BMI間無明顯相關(guān)性［14］。但對絕經(jīng)前健康美國婦女的研究發(fā)現(xiàn)，BsmⅠ位點的bb基因型與體質(zhì)量增加有關(guān)［13］。對瑞典絕經(jīng)前的健康婦女和法國兒童研究也同樣發(fā)現(xiàn)，BsmⅠ位點的bb基因型與脂肪量和體質(zhì)量增加有關(guān)［13］。以上研究說明，在歐洲人群中VDR基因多態(tài)性與BMI或肥胖間的關(guān)聯(lián)研究存在差異。同樣在亞洲和非洲也得到相似的結(jié)論。Al-Daghri等［15］通過研究402例肥胖 (BMI≥30 kg/m2)和489例健康 (BMI＜30 kg/m2)沙特阿拉伯兒童人群，結(jié)果顯示，TaqⅠ和BsmⅠ位點與肥胖具有相關(guān)性，ApaⅠ與肥胖無明顯相關(guān)性，但ApaⅠ與TaqⅠ、BsmⅠ組成的單倍體GTA和ACC與肥胖具有相關(guān)性。但在Al-Daghri等［16］的另外一項研究中，以沙特阿拉伯285例代謝綜合征和285例健康對照人群為研究對象，結(jié)果顯示，BsmⅠ位點B等位基因與肥胖相關(guān)，是肥胖的危險因素，但TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ均與肥胖無相關(guān)性。Dorjgochoo等［17］以6 922例25～70歲上海女性為研究對象，結(jié)果顯示，VDR基因與BMI間無相關(guān)性。Xu等［18］通過研究260例中國健康絕經(jīng)后婦女，結(jié)果顯示，ApaⅠ位點與BMI具有相關(guān)性。上海學(xué)者以來自400個家庭的1 215例參與者為研究對象，發(fā)現(xiàn)ApaⅠ、FokⅠ與BMI間無明顯相關(guān)性，尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(CDX-2)與BMI有關(guān)［19］。以上研究結(jié)果表明，VDR基因多態(tài)性與肥胖間的相關(guān)性，不僅存在位點差異，而且具有民族、地域、性別等差異?？紤]到基因位點的突變率在不同年齡、民族、種族等均存在差異，同時東西方的生活方式及環(huán)境因素不同，所以為驗證VDR基因多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性，有必要進行大規(guī)模、多地區(qū)的研究。

目前，關(guān)于人類VDR基因與肥胖的關(guān)系研究甚少且結(jié)論不統(tǒng)一，且研究對象多為成人，對兒童研究甚少。本研究以新疆伊犁地區(qū)7～12歲漢族和哈薩克族學(xué)齡兒童為研究對象，結(jié)果顯示，漢族健康學(xué)齡兒童ApaⅠ位點a等位基因頻率為68.3%，a為優(yōu)勢基因，與趙金秀等［20］、席衛(wèi)平等［21］報道相近;哈薩克族屬于高加索人種，A、a等位基因頻率基本相等，與Riggs等［22］研究一致;漢族健康學(xué)齡兒童BsmⅠ位點分布不均衡，其中b等位基因占絕對優(yōu)勢，與趙江霞等［23］研究一致，漢族等位基因頻率與韓國人的相似［24］，但低于白種人［25］。哈薩克族健康學(xué)齡兒童BsmⅠ位點多態(tài)性的分布以bb(62.9%)和Bb(35.5%)型為主，與陳瑞英等［26］研究結(jié)果 bb(47.0%)和 Bb(48.0%)不同，可能與不同研究的樣本選擇有關(guān)。這表明ApaⅠ、BsmⅠ位點多態(tài)性分布均有明顯的種族差異。

本研究結(jié)果還顯示，ApaⅠ位點的A、a等位基因在新疆伊犁地區(qū)病例組與對照組漢族學(xué)齡兒童間有差異，而兩組哈薩克族學(xué)齡兒童間無差異，提示ApaⅠ位點可能與漢族學(xué)齡兒童超重/肥胖有關(guān)，而與哈薩克族學(xué)齡兒童超重/肥胖無關(guān)。Al-Daghri等［15］研究沙特阿拉伯成人人群，結(jié)果顯示，ApaⅠ位點與肥胖無相關(guān)性，但與其TaqⅠ、BsmⅠ位點組成的單倍體GTA和ACC與肥胖有關(guān)。Xu等［18］與 Binh等［8］均通過研究絕經(jīng)后健康婦女顯示，ApaⅠ位點與BMI具有相關(guān)性。在沙特阿拉伯成人人群，BsmⅠ位點與肥胖具有相關(guān)性，等位基因B是肥胖的危險因素，且與TaqⅠ、BsmⅠ位點組成的單倍體ACC和GTA均與肥胖有關(guān)［14-15］。以健康婦女為研究對象，發(fā)現(xiàn)BsmⅠ位點的bb基因型與體質(zhì)量增加有關(guān)［13］。對瑞典絕經(jīng)前健康婦女、法國兒童的研究也同樣發(fā)現(xiàn)，BsmⅠ位點的bb基因型與脂肪量和體質(zhì)量增加有關(guān)［13］。但同樣以健康婦女為研究對象，波蘭學(xué)者研究顯示，BsmⅠ位點與BMI無相關(guān)性［27］。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，兩位點的交互作用與漢族、哈薩克族超重/肥胖學(xué)齡兒童亦無相關(guān)性。但在法國高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)，VDR基因TaqⅠ位點TT基因型和BsmⅠ位點bb基因型間的交互作用與其他基因型組合的人群相比，體質(zhì)量增加了9 kg(或BMI增加了4 kg/m2)，且增加了30%的肥胖發(fā)生率［28］。

以上研究結(jié)果表明，關(guān)于VDR基因多態(tài)性與超重/肥胖間的相關(guān)性研究，國內(nèi)外的學(xué)者研究結(jié)論不一致，有些甚至相互矛盾，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是:(1)樣本的來源不同:不同民族、不同人種間具有明顯遺傳異質(zhì)性，從人種學(xué)分類來說，漢族、日本和韓國屬于蒙古人種，哈薩克族、維吾爾族和歐美國家同屬高加索人種;(2)肥胖與基因的相關(guān)性研究存在諸多混雜因素，如群體的分層現(xiàn)象是一個極其重要但又常被忽視的混雜因素，同時環(huán)境因素也不可忽視，而環(huán)境因素的差異，致使遺傳因素與環(huán)境因素間的相互作用使肥胖病因的研究更加復(fù)雜;(3)不同年齡段的人群遺傳負荷不同，隨著年齡的增長，遺傳因素對肥胖的影響逐漸減弱，而環(huán)境因素對肥胖的影響逐漸增強。因此，在不同地區(qū)、不同人種人群，甚至是不同年齡段中進行大樣本多基因的研究，比較不同地區(qū)、不同人種、不同年齡段的遺傳學(xué)因素非常重要。肥胖是由多個微效基因相互作用的慢性代謝性疾病，其發(fā)生和發(fā)展并不是簡單的遵從孟德爾遺傳模式，而是由多個基因參與，受多種因素相互影響的結(jié)果。一般來說，單個基因位點可能對肥胖的影響較小，而多個基因位點的聯(lián)合作用卻能顯著放大這種作用。

本研究不足:(1)PCR-RFLP方法難以發(fā)現(xiàn)低頻率、高外顯但可能具有較強易患性的基因位點，這些變異位點可能比目前發(fā)現(xiàn)的變異位點的效應(yīng)更強。因此，需要利用基因定位或測序方法來識別這些重要的變異基因位點;(2)本研究對象僅為新疆伊犁地區(qū)漢族、哈薩克族7～12歲學(xué)齡兒童群體，未涉及居住于當?shù)氐钠渌褡寮捌渌貐^(qū)的同齡兒童;且由于樣本量的限制，未進行肥胖分度分析。作為基因多態(tài)性的相關(guān)性研究，研究結(jié)果不能推廣到整個人群，研究尚顯不足;(3)本研究為病例對照研究，選擇性偏倚難以避免，混雜因素也不能完全排除，可能會夸大或者削弱基因與疾病之間的關(guān)聯(lián)強度。今后本課題組將繼續(xù)致力于新疆學(xué)齡兒童肥胖的多基因位點及多因素的研究，為進一步探討學(xué)齡兒童肥胖的作用機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

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