劉臻 曹定睿

丙泊酚后處理對大鼠肝缺血再灌注損傷時腎細胞凋亡以及Bcl-2，Bax的影響

劉臻 曹定睿

目的 評價丙泊酚后處理對大鼠肝缺血再灌注時遠隔臟器腎臟細胞B淋巴細胞瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl相關X蛋白（Bax）的影響。方法 健康雄性SD大鼠54只，隨機分為3組（n=18）：假手術（S）組、缺血再灌注(IR)組、丙泊酚(P)組。每組再根據(jù)再灌注時間（2、4、6h）的不同各分成3個亞組，分別為S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6亞組。制備70%肝缺血再灌注模型，測定血液中胱抑素C（Cys-c），利用免疫組化方法檢測各組腎組織中Bcl-2蛋白和Bax的表達，TUNEL法檢測腎臟細胞的凋亡指數(shù)(AI)。結果 各組同一時間點相比，IR組和P組的Cys-c、Bcl-2、Bax蛋白含量，AI值均顯著高于S組（P＜0.05）。P組的Bcl-2、Bcl-2/Bax顯著高于IR組，Bax、Cys-c、AI值顯著低于IR組（P＜0.05）。結論 丙泊酚對肝缺血再灌注時腎臟損傷有保護作用，而其保護機制可能與調控Bcl-2、Bax蛋白的表達有關。

丙泊酚；肝缺血再灌注；腎損傷

肝缺血再灌注損傷(HIRI)是臨床外科常見的病理生理過程，可見于肝腫瘤切除、肝移植等手術。HIRI不僅會直接損傷肝臟本身，還會引起包括腎臟在內的其他遠隔臟器損傷[1]。而細胞凋亡在缺血再灌注（IR）損傷中發(fā)揮重要作用[2]。Bcl-2,Bax作為調控凋亡的蛋白，其表達水平間接反映了凋亡的情況，其中兩者此消彼長的關系與凋亡的程度密切相關[3]。丙泊酚因具有清除自由基的功效，從而可以產生一定的抗氧化作用[4]。腎臟是清除Cys-c的唯一場所，故腎小球濾過率決定了血清中Cys-c的濃度，且不受其他干擾因素(如炎癥、感染等)的影響。因此，Cys-c敏感性好、特異性高，可更好地反映腎小球濾過功能[5]，其濃度變化可體現(xiàn)腎臟的功能狀態(tài)。丙泊酚對肝缺血再灌注時肝臟的保護作用已得到肯定。已有研究發(fā)現(xiàn)HIRI發(fā)生時可以造成腎臟一定程度的損傷。目前，對HIRI的保護研究已從之前的關注肝臟本身發(fā)展到關注肝損傷時其他遠隔臟器的損傷，本研究通過建立HIRI模型，了解HIRI后腎臟的功能狀態(tài)，探討丙泊酚在HIRI中是否對腎臟有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠54只（體質量

180～250g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心）。丙泊酚注射液（Astra Zeneca公司，意大利，批號JY174）。免疫組化試劑盒、原位細胞凋亡試劑盒、DAB染色試劑盒pv-6000（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Bcl-2兔抗多克隆抗體（博士德生物公司，BA0414）。Bax兔抗多克隆抗體（博士德生物公司，BA0315）。

1.2 模型制備 大鼠于實驗前禁食12h，25%烏拉坦（1g/ kg）腹腔注射麻醉，平臥固定，消毒，上腹部正中切口，逐層分離顯露第一肝門后，暴露肝蒂、左、中葉，無創(chuàng)傷夾閉肝臟左、中葉的門靜脈，肝動脈分支，保留右葉、乳突葉、尾狀葉門靜脈分支。肝臟左，中葉表面顏色變灰顯示建立70%肝缺血模型成功。夾閉1h后恢復灌注，灰色部位恢復紅潤為再灌注成功標志。

1.3 實驗分組 54只大鼠隨機分為3組（n=18）：假手術（S）組、缺血再灌注(IR)組、丙泊酚(P)組。每組再根據(jù)再灌注時間（2、4、6h）分成3個亞組：分別為S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6共9個亞組。

1.3.1 假手術（S）組 僅暴露肝門，不做其他處理。尾靜脈以0.3mL/(kg·min)的速率持續(xù)泵注0.9%的生理鹽水10min，1h后關閉腹腔，此時刻視為再灌注起點，于2h時對S2組的6只大鼠行游離左腎，結扎腎蒂，取左腎標本，心室取血后當即離心，冷凍保存，處死動物。同樣4h時得到S4組的6份標本，6h時得到S6的6份腎及血清標本。

1.3.2 缺血再灌注(IR)組 暴露肝門，夾閉相應動靜脈，造成肝缺血損傷，同樣以0.3mL/(kg·min)的速率持續(xù)泵注0.9%的生理鹽水10min，1h后再灌注。分別在上述各時刻得到IR2、IR4、IR6亞組的血清及腎組織標本。

1.3.3 丙泊酚(P)組 暴露肝門，夾閉相應動靜脈造成肝缺血損傷，以3mg/(kg·min)的速率持續(xù)泵注丙泊酚注射液10min，1h后再灌，得到P2、P4、P6亞組標本。

1.4 腎組織病理檢查 取左腎下極組織甲醛固定，石蠟包埋，切片，染色，光鏡下觀察腎組織細胞形態(tài)。

1.5 腎組織Bcl-2,Bax蛋白含量測定 利用免疫組化二步法，檢測其表達情況。顯微鏡下每張切片隨機選取5個視野觀察，通過美國aperio公司的scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)軟件分析，得到陽性區(qū)域平均光密度（optical density OD）值。OD值的高低反映Bcl-2,Bax蛋白含量的表達水平。

1.6 原位細胞凋亡檢測 用TUNEL法對腎組織切片細胞凋亡行原位檢測，每個標本隨機選取5個視野，計算AI。

1.7 血清胱抑素檢測 抽取樣本后分離血清，冷凍保存，采用全自動血液生化分析儀(COBAS 501)測定Cys-c的濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。各組實驗數(shù)據(jù)均以“x±s”表示。不同組間比較采用單因素方差分析，若結果差異有統(tǒng)計學意義，則繼續(xù)采用SNK檢驗進行進一步比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織病理學結果 S2、S4、S6亞組腎小球與腎小管均未發(fā)生明顯形態(tài)學改變，IR2、IR4、IR6各亞組腎小管的上皮細胞明顯腫脹變形，空泡樣改變，間質水腫，腎小管擴張，有部分脫落壞死細胞，可見管型，炎細胞浸潤，腎小管周圍血管淤血擴張明顯。P2、P4、P6亞組少量腎小管上皮細胞輕度水腫，管型罕見，腎小管周圍輕度淤血，極少炎細胞浸潤。

2.2 腎組織中Bcl-2,Bax蛋白含量及AI變化 所有結果進行組間比較。同一時刻，與S組比較，IR、P組Bcl-2,Bax蛋白含量，AI值顯著增加（P＜0.05）；與IR組相比，P組Bcl-2含量、Bcl-2/Bax值顯著增加，Bax含量、AI值顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 3組不同時相肝組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白及其比值(x±s)

2.3 血清中Cys-c含量變化 所有結果進行組間比較。同一時刻，與S組比較，IR,P組Cys-c含量顯著增加(P＜0.05)；與IR相比，P組Cys-c值顯著減小(P＜0.05)。見表2。

3 討論

缺血再灌注損傷的機制目前并未完全研究徹底，可能與細胞凋亡，氧自由基爆發(fā)性產生、鈣超載等有關，丙泊酚作為目前臨床廣泛應用的靜脈麻醉藥已經(jīng)證實有抑制細胞炎癥因子釋放和抗氧化作用[7]。并在HIRI中對凋亡具有明確的抑制作用[8]。

本研究結果顯示，同一時刻，與IR組比較，P組Cys-c顯著降低，Bcl-2/Bax顯著降低，腎組織損傷程度減輕，且Bcl-2蛋白含量顯著增加，Bax蛋白含量顯著減少，提示丙泊酚對HIRI時腎臟的保護作用很可能與調控Bcl-2,Bax蛋白的表達相關，Bcl-2蛋白主要位于線粒體外膜，與抑制細胞凋亡有關，Bax蛋白位于胞質，起到促進細胞凋亡的作用。兩者的比例決定了細胞凋亡的程度。

綜上所述，丙泊酚通過上調Bcl-2，下調Bax的表達，使Bcl-2/Bax比值升高抑制凋亡，減輕損傷，丙泊酚后處理對HIRI時腎臟的損傷具有保護作用，可能與調控Bcl-2,Bax蛋白表達發(fā)揮作用，但具體的調控機制還有待進一步研究。

表2 3組不同時相AI及Cysc（x±s）

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Objective To investigate the effect of post-conditioning with Propofol on apoptosis and the expression of bcl-2,bax gene in renal tissue after hepatic ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods Fifty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups, including sham group (S), ischemia-reperfusion group (IR), propofol group (P). According to the different periods after reperfusion, each group was further divided into 2-hour 4-hour and 6-hour reperfusion subgroups respectively (n=6 in each subgroup), named S2、S4、S6 subgroups,andI R2、IR4、IR6 subgroups, and P2、P4、P6 subgroups. Make the 70% hepatic ischemia-reperfusion model. The blood was sampled at the end of ischemia-reperfusion for assay of cystatin c（Cys-c）the apoptosis rate(AI) in ischemia-reperfusion renal tissure were measured by TUNEL method; the bcl-2,bax concentration were measured by immuno-histochemistry. Results Different group compared to the sametime. Blood concentrations of Cys-c ,AI, and the amount of bcl-2 and bax protein after reperfusion in group IR, and group P were higher than those in group S at matched reperfusion time points (P＜0.05).The amount of bcl-2 and bcl-2/bax in group P were higher than those in group IR, but the amount of bax, AI and the concentrations of Cys-c in group P were lower than those in group IR (P＜0.05). Conclusion Propofol can alleviate renal injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats, in which the bcl-2 and bax protein may play important roles.

Propofol; Hepatic ischemia-reperfusion; Renal injury

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.23.008

山西 030001 山西醫(yī)科大學附屬一院麻醉科 （劉臻 曹定睿）

曹定睿 E-mail:cdr128@126.com