潘奇，陳介南，張新民，詹鵬，張林

（1 中南林業(yè)科技大學(xué)國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004；2 中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

生物乙醇是一種燃燒熱值大、CO2排放量低的可再生燃料，與汽油或柴油以一定比例混合使用，不僅節(jié)約了不可再生能源，而且改善了燃燒過程，降低了有害物質(zhì)的生產(chǎn)和排放，對生物乙醇的研究正日益受到廣泛關(guān)注[1]。利用木質(zhì)纖維這種豐富廉價(jià)的“非糧”原料酶解發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是解決能源匱乏的重要途徑，被稱為“第二代”生物乙醇，但是由于木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)復(fù)雜，酶解發(fā)酵技術(shù)仍需不斷完善，而且生產(chǎn)成本較高等問題，導(dǎo)致木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物乙醇一直沒有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。研究表明，發(fā)酵殘?jiān)谐形疵附獾睦w維素、半纖維素和其他雜質(zhì)外，還含有大量的木質(zhì)素[2]，木質(zhì)素化學(xué)活性較高，對其進(jìn)行化學(xué)改性后的產(chǎn)品，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于膠黏劑[3-5]、表面活性劑[6-7]、減水劑[8-9]等工業(yè)領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用潛力也十分廣闊，如復(fù)合緩釋肥料、農(nóng)藥緩釋劑等在農(nóng)業(yè)中的用量也很大。木質(zhì)纖維酶解發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇過程中的殘?jiān)ǔ１恢苯臃贌洚?dāng)燃料，不僅經(jīng)濟(jì)效益不高，而且對環(huán)境造成了一定的污染，對這些木質(zhì)素進(jìn)行回收利用將提高木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化生物乙醇工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，對促進(jìn)纖維乙醇工業(yè)的發(fā)展有重大意義。

木質(zhì)素的分離方法主要有酸法、堿法、有機(jī)溶劑法，不同的分離方法分離的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)有所差異。酸法是利用一定濃度的酸性溶液降解纖維素和半纖維素，從而分離得到酸不溶木質(zhì)素，酸可以是有機(jī)酸或者無機(jī)酸，Klason 法是常用的測定與分離木質(zhì)素的方法；堿法提取木質(zhì)素的原理是木質(zhì)素含有大量酚羥基，呈弱酸性，不溶于水，在堿溶液中形成木質(zhì)素復(fù)合物而溶解，用酸作為沉淀絮凝劑，析出木質(zhì)素，從而分離出木質(zhì)素[10]；有機(jī)溶劑法是利用有機(jī)溶劑溶解木質(zhì)素，經(jīng)過沉淀，回收溶劑，分離得到木質(zhì)素，不同有機(jī)溶劑分離得到的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)有所差異[11-13]。

本工作采用一般堿法對發(fā)酵殘?jiān)械拿附饽举|(zhì)素進(jìn)行分離，研究了堿濃度、料液比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間各因素對木質(zhì)素提取效果的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取條件，并對提取出的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以期為酶解木質(zhì)素進(jìn)一步改性應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

楊木纖維乙醇發(fā)酵殘?jiān)蓢伊謽I(yè)局生物乙醇研究中心提供，其他試劑均為市售分析純。FZ102型微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf AG 22331 型高速離心機(jī)，德國艾本德公司；JA2003 電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-2450 型紫外可見光分光光度計(jì)，島津公司；FT-IR-8400s 型紅外光譜儀，島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

蠟、脂肪、樹脂、色素等物質(zhì)容易與木質(zhì)素形成縮合物，從而被一起分離出來。甲苯具有溶解樹脂、蠟、脂肪等的能力，乙醇又能溶出樹脂、單寧酸、色素、部分碳水化合物和微量的木質(zhì)素，所以用苯醇混合物對原料進(jìn)行抽提，將這些雜質(zhì)除 去[14]。

將楊木纖維乙醇發(fā)酵殘?jiān)诤嫦渲?0℃干燥，粉碎，過60 目篩。采用甲苯與乙醇（V∶V=2∶1）混合溶劑對粉碎的殘?jiān)M(jìn)行索氏抽提6h，回收甲苯- 乙醇溶劑，將抽提后的殘?jiān)?0℃烘箱中烘干，得本實(shí)驗(yàn)所用的原料，備用。

1.2.2 楊木纖維乙醇發(fā)酵殘?jiān)心举|(zhì)素含量的測定

采用72%硫酸法[15]測定楊木纖維乙醇發(fā)酵殘?jiān)心举|(zhì)素含量，稱量預(yù)處理樣品1.0000g，移入100mL 燒杯中，加入約20℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 72% 硫酸 15mL，充分?jǐn)嚢柚?，?0℃ 下放置4h，將其移入1000mL 的圓底燒瓶中，以 560mL 蒸餾水洗滌后移入燒瓶中，加上回流冷凝管，煮沸4h，生成的不溶性殘?jiān)靡押阒氐牟Ａ┒烦闉V，以熱水洗凈，105℃下干燥至恒重，稱量，計(jì)算產(chǎn)率，平行測 3 次，取平均值即為克拉森木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

將1.0000g 預(yù)處理樣品放在坩堝中，于560℃的馬弗爐中灼燒至恒重，計(jì)算灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平行測 3 次，再按下式計(jì)算木質(zhì)素的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

樣品中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)= 克拉森木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)－樣品總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

本研究殘?jiān)心举|(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.78%。

1.2.3 木質(zhì)素的提取

稱取5.0g 預(yù)處理的原料，加入一定濃度的NaOH 溶液，在某水浴溫度下恒溫浸泡提取一段時間，過濾，濾渣可以繼續(xù)回收作為生產(chǎn)楊木纖維乙醇的原料，濾液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至1.5，析出沉淀，在常溫下靜置隔夜，有明顯分層，去除上層清液，離心分離，沉淀先用pH=2 的鹽酸溶液洗滌離心，再用蒸餾水洗滌離心，沉淀于60℃烘箱中烘干，即得到酶解木質(zhì)素。

1.2.4 木質(zhì)素分離的單因素試驗(yàn)

分別以不同濃度的NaOH（10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L），料液比[原料質(zhì)量(g)∶堿溶液體積(mL)，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50]，反應(yīng)溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），反應(yīng)時間（1h、1.5h、2h、2.5h、3h）為單因素，考察各因素對酶解木質(zhì)素得率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 L9(34)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步分析堿濃度、料液比、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間對木質(zhì)素得率的影響，優(yōu)化木質(zhì)素提取工藝。

1.2.6 木質(zhì)素表征

紫外光譜測定：取少量干燥的本實(shí)驗(yàn)所提取的酶解木質(zhì)素樣品，溶于乙醇中，并以乙醇為空白，用紫外分光光度計(jì)測其在200～400nm 內(nèi)的吸收 光譜。

紅外光譜測定：取少量干燥的本實(shí)驗(yàn)所提取的木質(zhì)素樣品，磨成粉末，再與溴化鉀粉末混合均勻，壓成薄片，利用紅外光譜儀測定其紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 NaOH 濃度對木質(zhì)素提取得率的影響

在料液比1∶30、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間2h條件下，考察不同NaOH 濃度對酶解木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

如圖1 所示，當(dāng)堿濃度小于40g/L 時，酶解木質(zhì)素的得率隨著堿濃度的增大而升高，當(dāng)濃度為40g/L 時酶解木質(zhì)素得率最大，繼續(xù)增大堿濃度，得率反而下降，這說明，酶解木質(zhì)素在一定堿濃度溶液中，有很好的溶解性，濃度為40g/L 時，酶解木質(zhì)素提取效果達(dá)到最佳，繼續(xù)增大堿濃度，可能對酶解木質(zhì)素基鹽在堿溶液中的溶解造成一定阻礙，所以當(dāng)堿濃度大于40g/L 時，酶解木質(zhì)素的得率呈略微下降的趨勢，因此，選取合適的堿濃度水平30g/L、40g/L、50g/L 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 堿濃度對木質(zhì)素得率的影響

圖2 料液比對木質(zhì)素得率的影響

2.1.2 料液比對木質(zhì)素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間2h條件下，考察不同料液比對酶解木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

如圖2 所示，當(dāng)料液比大于1∶30 時，酶解木質(zhì)素的得率隨著料液比的減小而增大，料液比為1∶30g/mL 時，得率達(dá)到最大，隨著料液比的繼續(xù)減小，酶解木質(zhì)素的得率有所下降，適當(dāng)?shù)膲A溶液體積對酶解木質(zhì)素的提取有很好的促進(jìn)作用，因此，選取合適的料液比水平 1∶20g/mL、1∶30g/mL、1∶40g/mL 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 反應(yīng)溫度對木質(zhì)素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、料液比1∶30、反應(yīng)時間2h條件下，考察不同反應(yīng)溫度對酶解木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

如圖3 所示，當(dāng)反應(yīng)溫度在30～60℃范圍內(nèi)時，酶解木質(zhì)素的得率隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)到60℃，酶解木質(zhì)素的得率最大，繼續(xù)升高溫度，酶解木質(zhì)素的得率反而減小，這可能是反應(yīng)溫度在30～60℃范圍內(nèi)時，隨著反應(yīng)溫度的升高，原料中的酶解木質(zhì)素與其他物質(zhì)分離，并形成了溶解性較好的木質(zhì)素復(fù)合物，在酸性環(huán)境中還原出了酶解木質(zhì)素，得到了較好的提取效果，反應(yīng)溫度大于60℃時，可能對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)造成了一定影響，不能很好的溶解于堿溶液中，從而使得酶解木質(zhì)素的得率減小，因此，選取合適的反應(yīng)溫度水平50℃、60℃、70℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 反應(yīng)溫度對木質(zhì)素得率的影響

2.1.4 反應(yīng)時間對木質(zhì)素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、料液比1∶30g/mL、反應(yīng)溫度60℃條件下，考察不同反應(yīng)時間對酶解木質(zhì)素提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 反應(yīng)時間對木質(zhì)素得率的影響

如圖4所示，當(dāng)反應(yīng)時間少于2h時，酶解木質(zhì)素的得率隨著反應(yīng)時間的延長而增大，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到2h 時，得率最大，繼續(xù)延長反應(yīng)時間對得率的影響不大，且有略微下降?？赡苁怯捎诜磻?yīng)時間為2h 時，酶解木質(zhì)素在堿溶液中的溶解已經(jīng)達(dá)到飽和，延長反應(yīng)時間有部分酶解木質(zhì)素因?yàn)榫鄯e而析出，導(dǎo)致得率略微下降，所以選取合適的反應(yīng)時間水平1.5h、2h、2.5h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 酶解木質(zhì)素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的研究結(jié)果，將堿濃度、料液比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間作為考察因素，按照 L9(34)正交試驗(yàn)對酶解木質(zhì)素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1 和表2。

由表2 可知，各因素對酶解木質(zhì)素得率的影響最大的是堿濃度，其次是反應(yīng)溫度、料液比，最后是反應(yīng)時間。最佳的工藝條件組合是NaOH 濃度40g/L、反應(yīng)溫度60℃、料液比1∶30g/mL、反應(yīng)時間2.5h。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)結(jié)果

對正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3 次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到酶解木質(zhì)素的得率分別為37.5%、37.45%、37.08%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，在最佳工藝條件下，酶解木質(zhì)素的平均得率為37.34%，優(yōu)于表2 中任一試驗(yàn)。

2.3 紫外光譜分析

在200～400nm 范圍內(nèi)掃描，測得本實(shí)驗(yàn)所提取的酶解木質(zhì)素紫外光譜如圖5 所示，在230nm 附近有較強(qiáng)的吸收帶，說明具有較大的不飽和度，在280nm 附近出現(xiàn)寬肩峰是苯環(huán)的特征吸收峰，表明所測樣品為芳香族化合物，這與紅松木質(zhì)素、云杉木質(zhì)素、棉稈木質(zhì)素的紫外光譜圖接近[15-17]。

圖5 酶解木質(zhì)素的紫外吸收光譜

2.4 紅外光譜分析

本實(shí)驗(yàn)所提取酶解木質(zhì)素的紅外光譜圖如圖6所示。與光譜圖對應(yīng)的各吸收峰歸屬分析見表3[18-20]。由表3 分析可知，發(fā)酵殘?jiān)械拿附饽举|(zhì)素結(jié)構(gòu)單元主要是紫丁香基，其中側(cè)鏈還有各種功能基團(tuán)，如羥基、甲基、羰基等，酶解木質(zhì)素是一種具有一定化學(xué)活性的物質(zhì)，能夠?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)改性，應(yīng)用到各相關(guān)領(lǐng)域中。該紅外光譜與油茶殼[21]木質(zhì)素和酶解玉米秸稈木質(zhì)素[22]的紅外光譜基本一致。

3 結(jié) 論

圖6 酶解木質(zhì)素的紅外光譜圖

表3 酶解木質(zhì)素的紅外光譜吸收表

（1）本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對一 般堿法提取發(fā)酵殘?jiān)忻附饽举|(zhì)素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的提取工藝為 NaOH 濃度 40g/L、料液比1∶30、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間2.5h。在最佳工藝條件下，酶解木質(zhì)素得率達(dá)到37.34%，對正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析可知，堿濃度對酶解木質(zhì)素的提取影響顯著，選擇合適的堿濃度至關(guān)重要。

（2）提取得到的酶解木質(zhì)素為紫黑色塊狀固體，研磨得到棕褐色粉末，不溶于水，通過紫外光譜和紅外光譜分析，驗(yàn)證了酶解木質(zhì)素的芳香族結(jié)構(gòu)，以紫丁香基木質(zhì)素為主，而且具有羥基、羰基、甲氧基等活性基團(tuán)，為其進(jìn)一步改性應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

（3）采用一般堿法提取發(fā)酵殘?jiān)械拿附饽?質(zhì)素，具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、提取率較高等優(yōu)點(diǎn)。提取的酶解木質(zhì)素具有良好的化學(xué)活性，可以對其進(jìn)行改性，得到高附加值的產(chǎn)品，應(yīng)用到工農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域。由于發(fā)酵殘?jiān)心举|(zhì)素的提取，殘?jiān)心举|(zhì)纖維結(jié)構(gòu)更為松散，纖維素酶更易與纖維素和半纖維素接觸，可以對其進(jìn)行再次酶解發(fā)酵制取生物乙醇。這些都能降低木質(zhì)纖維乙醇的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。

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