周鵬（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州350002）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀耳中米酵菌酸

周鵬
（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州350002）

摘要：建立了快速測定銀耳中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品采用甲醇提取，混合強陰離子交換固相萃取柱（PAX）凈化，UPLCBEH C18（2.1×100mm，1.7μm）色譜柱分析，以10mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相，梯度洗脫，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子模式檢測，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，米酵菌酸在1.6μg/L～80μg/L線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r）0.999 9，檢出限0.5μg/kg，加標(biāo)回收率82%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤8.5%。本方法快捷準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于銀耳中米酵菌酸的確證方法。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；米酵菌酸；銀耳；固相萃??；基質(zhì)效應(yīng)

米酵菌酸（bongkrekic acid，BKA）是椰毒假單胞菌酵米面亞種代謝物中的一種，它存在于發(fā)酵食品、變質(zhì)銀耳等食物中，毒性較強，食用者會出現(xiàn)惡心、嘔吐、抽搐、休克等中毒癥狀，損傷肝、腦神經(jīng)細胞以及腎臟組織[1-2]，致死率高達40%～100%，在我國引起多起食物中毒事件，需嚴(yán)加防范。近期研究又發(fā)現(xiàn)米酵菌酸對細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔有抑制作用，從而又開始對米酵菌酸的生物合成及其在細胞凋亡、損傷等方面展開了大量的研究[3-8]。在我國最新頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中[9-10]明確規(guī)定了銀耳中米酵菌酸含量小于0.25mg/kg。目前米酵菌酸的檢測方法較少，主要有液相色譜法[11]、薄層色譜法[11]以及紫外分光光度法[12]，液質(zhì)聯(lián)用分析法還鮮見報道。現(xiàn)有方法處理復(fù)雜，靈敏度差、易受到樣品基質(zhì)的干擾，使得測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。根據(jù)我國相關(guān)規(guī)定：基于色譜分析而沒有使用分子光譜測定的方法，不能用于確證方法[13]。因此，急需開發(fā)一種處理快速、特異性強、靈敏度高的分析方法，作為銀耳中米酵菌酸的確證方法。

1　材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

1290超高效液相色譜儀串聯(lián)6490三重四級桿質(zhì)譜儀：均為美國Agilent公司；離心機：Avanti；J-E冷凍高速離心機：美國貝克曼公司；DS-8510DTH超聲波清洗機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；VORTEXMAX II型渦旋混合器：美國Thermo Scientific公司；固相萃取儀：美國安捷倫科技公司。

1.0mg/m L米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：美國Merck公司；乙酸銨（優(yōu)級純）：北京百靈威科技公司；氫氧化鈉、氨水、磷酸（均為分析純）：國藥集團；試驗用水：milli-Q制備的超純水；混合強陰離子交換固相萃取柱（PAX，60mg/3mL）：艾杰爾公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取0.50mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25mL容量瓶中，甲醇定容，配制成20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用50%甲醇溶液稀釋定容，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃下避光保存。

1.3液相色譜條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18＞2.1×100mm＞1.7μm；柱溫：40℃；進樣量：2.0μL；流速：0.3m L/min；流動相A：0.01mol/L乙酸銨，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序為：0～4min，20%B-40%B；4.01min～6min，90%B；6.01min～8.0min，20%B。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；脫溶劑氣溫度：160℃；脫溶劑氣流速：16L/min；霧化氣壓力：241.3kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：0 V。監(jiān)測離子對為485.1/441.1、485.1/397.2，定量離子對為485.1/441.1。

1.4樣品前處理

樣品經(jīng)高速粉碎機粉碎后，準(zhǔn)確稱取2.0g于50mL具塞離心管中，加入10mL甲醇渦旋混勻，超聲輔助提取30min。4000 r/min離心5min，準(zhǔn)確移取5mL上層清液于5mL刻度氮吹管中，40℃下氮吹至干，加入3mL 0.1mol/LNaOH渦旋復(fù)溶后過PAX柱（固相萃取柱使用前分別用3mL甲醇、3mL 0.1mol/LNaOH活化，保持柱體濕潤），再分別用3mL1%氨水（體積分?jǐn)?shù)）、3mL1%氨水甲醇（體積分?jǐn)?shù)）溶液淋洗，棄去淋洗液，抽干，最后用3mL 0.5%甲酸甲醇（體積分?jǐn)?shù)）洗脫，洗脫液于45℃下氮吹至近干，用50%甲醇水（體積分?jǐn)?shù)）溶液定容至1.0mL，過0.22μm尼龍濾膜后上機測試。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理條件優(yōu)化

現(xiàn)有的米酵菌酸處理方法為液液萃取法[9-10]，采用固相萃取法分析米酵菌酸還鮮見報道，需進一步優(yōu)化。試驗采用2.0mg/L米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察了親水親脂固相萃取柱（PEP，60mg/3mL）、混合弱陰離子交換柱（PWAX，60mg/3mL）、混合強陰離子交換柱（PAX，60mg/3mL）以及中性氧化鋁柱（500mg/3mL）的保留特性。米酵菌酸經(jīng)PEP、PWAX、中性氧化鋁柱處理后，回收率為0%，而經(jīng)PAX柱處理后，回收率可達到95%以上。分析發(fā)現(xiàn)，米酵菌酸極性較強，在PEP柱上無法保留，并且在PWAX柱上也無法保留，而在中性氧化鋁柱上的保留又過強，難以洗脫；米酵菌酸在PAX柱上具有良好的保留特性，洗脫容易，回收率接近100%，適合米酵菌酸的富集、凈化。試驗發(fā)現(xiàn)，pH對米酵菌酸的洗脫強度有很大影響，考察了洗脫液中不同濃度甲酸對洗脫強度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫液中不含甲酸時幾乎無法洗脫米酵菌酸，當(dāng)甲酸濃度大于0.2%以后洗脫完全，且隨著甲酸濃度的增大，回收率幾乎無變化，試驗結(jié)果見圖1。

圖1　不同甲酸濃度對洗脫強度的影響Fig.1　Effect of different concentration of form ic acid on the elution strength

考慮到基質(zhì)的影響以及溶液配制的穩(wěn)定性，最終選擇了0.5%甲酸甲醇溶液作為洗脫劑。

2.2色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化與基質(zhì)效應(yīng)

試驗比較了乙腈-水、乙腈-0.3%甲酸、乙腈-0.01mol/L乙酸銨作為流動相對色譜峰型以及靈敏度的影響。由于米酵菌酸有3個羧基，具有一定極性，采用乙腈-水體系色譜峰變形嚴(yán)重，難以識別；采用乙腈-0.3%甲酸可以獲得較好的色譜峰型，但是本試驗采用的電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式（ESI-）進行檢測，抑制了米酵菌酸的電離，靈敏度較低；采用乙腈-0.01mol/L乙酸銨體系可以獲得較好的峰形以及較高的靈敏度。因此，本試驗最終采用乙腈-0.01mol/L乙酸銨體系作為流動相。

試驗采用2.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣，不經(jīng)色譜柱分離，直接進入三重四級桿質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。米酵菌酸容易失去一個質(zhì)子形成[M-H]-離子，因此采用負(fù)離子模式進行檢測。試驗過程中優(yōu)化了鞘氣溫度及流量、霧化氣壓力、去溶劑氣溫度及流速、毛細管電壓、噴嘴電壓、碰撞氣能量以及碰撞池加速電壓等參數(shù)，并選擇[M-H]-離子（m/z485.1）為母離子。選定母離子后，進行子離子掃描，獲得二級質(zhì)譜圖，見圖2。

圖2　米酵菌酸的二級質(zhì)譜圖Fig.2　Massspectrum of Bongkrekic acid by daughter scan

由圖可見主要特征碎片為m/z441.1和m/z397.2，推測分別為[M-H-CO2]-和[M-H-2CO2]-峰。

2.3基質(zhì)效應(yīng)的探討

不同于傳統(tǒng)的熒光或紫外-可見光檢測器，電噴霧質(zhì)譜雖然對分離度的要求大為降低，基質(zhì)不會影響到目標(biāo)化合物的分離度，但是在其離子化過程中會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，從而影響檢測的準(zhǔn)確度。通常降低基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有稀釋進樣溶液、基質(zhì)匹配標(biāo)樣以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法等，它們均有各自的優(yōu)缺點，提高凈化效率是最重要的途徑[14-16]，但是也很難完全消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

試驗采用濃度為40μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)樣進行試驗，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)梯度洗脫程序，米酵菌酸的峰面積變化很大，說明不同梯度洗脫條件下，米酵菌酸與基質(zhì)的分離度差別很大，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)差異很大，最終選擇了響應(yīng)最大的為最佳洗脫條件，試驗結(jié)果見圖3。

圖3　不同梯度洗脫程序米酵菌酸響應(yīng)的影響Fig.3　Effectof differentgradientelution program on bongkrekic acid response

在優(yōu)化后的洗脫程序下，分別采用濃度為40μg/L的純?nèi)軇┡渲茦?biāo)樣與基質(zhì)匹配標(biāo)樣，改變樣品的進樣量，分析米酵菌酸峰面積的變化，并進行數(shù)據(jù)擬合。理論上待測化合物的峰面積與進樣量應(yīng)為線性關(guān)系，但是基質(zhì)匹配的標(biāo)樣在進樣量小于2μL時，峰面積與純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)樣極為接近，即基質(zhì)效應(yīng)很??；隨著進樣量的增大，峰面積與溶劑配制的標(biāo)樣差別增大，即基質(zhì)效應(yīng)變強，對目標(biāo)化合物的抑制越來越強；當(dāng)進樣量超過5μL時，進樣量對目標(biāo)化合物的響應(yīng)影響有限。試驗結(jié)果表明：進樣量對基質(zhì)效應(yīng)的影響顯著，采用液質(zhì)聯(lián)用法進行分析時，不能依靠加大進樣量來提高方法的檢出限?？紤]到方法的靈敏度與基質(zhì)效應(yīng)，選擇2μL為本試驗的進樣量，試驗結(jié)果見圖4。

圖4　不同進樣量對米酵菌酸響應(yīng)的影響Fig.4　Effectof different inject volumeon on bongk rekic acid response

2.4分析方法確證

在上述優(yōu)化條件下，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量，考察了米酵菌酸在（1.6～80）μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。以空白樣品基質(zhì)中米酵菌酸3倍信噪比，確定化合物的檢出限為0.5μg/kg，方法的靈敏度能夠滿足檢測要求。

對空白銀耳樣品在2.0、10、20μg/kg 3個加標(biāo)水平下進行米酵菌酸的加標(biāo)回收試驗，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見表1。

表1　米酵菌酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及精密度（n=6）Table1　Linear range，regression equations，cor relation coefficient，recoveriesand precision ofbongkrekic acid（n=6）

試驗結(jié)果表面：在3個添加水平下，米酵菌酸的回收率為82%～102%，符合分析準(zhǔn)確度要求；相對偏差為2.4%～8.5%，符合精密度要求。

3　結(jié)論

本研究建立了固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測銀耳中米酵菌酸的方法。通過對分析方法的優(yōu)化，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，建立了快速、準(zhǔn)確、靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀耳中米酵菌酸的方法，同時本方法可作為分析的確證方法，為保障食品安全發(fā)揮積極作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.031

收稿日期：2014-05-11

基金項目：福建省科技廳民生科技專項資助項目（2013Y6003）

作者簡介：周鵬（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：復(fù)雜體系分離分析。

Determ ination of Bongkrekic Acid in Trem ella Fuciform is Berk by U ltra H igh Perform ance Liquid Chrom atography-tandem M ass Spectrometry

ZHOUPeng （Fujian Inspection and Research Institute for ProductQuality，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：A method based on ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）was developed for determination of bongkrekic acid（BAK）in tremella fuciformisberk.The samplewasextracted withmethanol，and then cleaned up by anion exchange solid-phase extraction（SPE）.The targetanalytewasseparated on UPLCBEH C18（2.1×100mm，1.7μm）column，0.01mol/L ammonium acetate and acetonitrile as the mobile phase gradient elution，detected by MS/MS system under negative electrospray ionization（ESI-）modewithmultiple reaction ionmonitoring（MRM）.The detection limit was 0.5μg/kg.The linear correlation coefficientwas 0.999 9.The recovery ranged from 82%to 102%with RSD less than 8.5%.Thismethod was suitable for the identification and quantification of bongkrekic acid in tremella fuciformisberk due to itssimplicity，good purification and high sensitivity.

Key words：ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）；bongkrekic acid（BKA）；tremella fuciformisberk；solid phase extraction（SPE）；matrix effect