孫高英，胡禮淵，廖和菁，劉瑞芳，竇曉明，候方妮（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

超聲萃取法檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫

孫高英，胡禮淵，廖和菁，劉瑞芳，竇曉明，候方妮
（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

摘要：探索了使用超聲萃取水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫的高效液相熒光檢測(cè)方法，通過(guò)試驗(yàn)獲得最佳方案。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間為15 min。本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范圍內(nèi)具有很好的線性，相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，最低檢出限為0.5 μg/kg。采用不同的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1%～3%。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；結(jié)晶紫；超聲波萃取

孔雀石綠（malachite green，MG）和結(jié)晶紫（crystal violet，CV）在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，常作為抗真菌感染和殺滅寄生蟲(chóng)，用于防治各種魚(yú)病[1-3]。該類物質(zhì)在魚(yú)體內(nèi)代謝為隱色孔雀石綠（LMG）和隱色結(jié)晶紫（LCV）（見(jiàn)圖1），具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變作用[4-7]，且孔雀石綠在魚(yú)體及其他生物體內(nèi)會(huì)經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化成無(wú)色孔雀石綠，其危害更大，殘留時(shí)間也更長(zhǎng)，現(xiàn)在已被被歐美國(guó)家、日本列為不得檢出的禁用藥物[8-9]，中國(guó)于2002年5月將孔雀石綠列為禁用藥[10]。

本方法以國(guó)標(biāo)GB/T20361-2006《水產(chǎn)品孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》為基礎(chǔ)，結(jié)合實(shí)際，加以適當(dāng)優(yōu)化，建立了高效液相色譜的快速篩選方法，同時(shí)探討測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的一些問(wèn)題。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器設(shè)備

1.1.1試劑

乙腈、甲醇、二氯甲烷為色譜純；冰乙酸、鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸、氨水、乙酸銨為分析純；孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫：純度≥98%。提取液：鹽酸羥胺3 g，對(duì)甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中；硼氫化鉀（0.1 mol/L）現(xiàn)配現(xiàn)用；陽(yáng)離子交換柱：PRS柱，500 mg、3 mL；乙酸銨緩沖溶液：稱取9.64 g無(wú)水乙酸銨溶解于1 000 mL水中，用冰乙酸調(diào)pH到4.5；乙酸銨緩沖溶液（0.1 mol/L）：稱取0.77 g無(wú)水乙酸銨溶解于100 mL水中，用氨水調(diào)pH到10；洗脫液：乙酸銨溶液：乙腈：1∶1（體積比），臨用前配制；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：吸取孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈稀釋成1 μg/mL，-18℃避光保存（因孔雀石綠結(jié)晶紫在常溫及冷藏下均可降解[11]）。

1.1.2儀器設(shè)備

1200型高效液相色譜儀（配有熒光檢測(cè)器、固相萃取裝置）、旋轉(zhuǎn)N-1000蒸發(fā)儀：美國(guó)Agilent公司；高速離心機(jī)：時(shí)代北利DT5-1（原LD4-2A）。

1.2測(cè)定方法

1.2.1提取

稱取處理好的樣品約5.00g置于50mL離心管中，加入10mL的乙腈，加入酸性氧化鋁5g，震蕩2min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入二甘醇2 mL，3 mL硼氰化鉀具塞，劇烈振搖2 min。

在50 mL離心管中繼續(xù)加入1.5 mL的鹽酸羥胺溶液、2.5 mL對(duì)-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸銨緩沖溶液，振蕩2 min，再加入10 mL的乙腈，繼續(xù)振蕩2 min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心10 min，上清液并入125 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入20 mL二氯甲烷，具塞劇烈振搖2 min，靜置分層，將下層溶液轉(zhuǎn)移至250 mL茄形瓶中，繼續(xù)在分液漏斗中加入5mL乙腈，10mL二氯甲烷，振搖2min，將全部溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管，4000r/min離心10 min，將下層溶液并入250 mL茄形瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用3 mL乙腈溶解殘?jiān)?/p>

1.2.2凈化

將PRS柱子接到固相萃取裝置上，上端接酸性氧化鋁柱，先用5 mL的乙腈分兩次活化柱子，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，然后用2.5 mL乙腈洗滌茄形瓶?jī)纱?，依次過(guò)柱，棄去酸性氧化鋁柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情況下，加入3 mL等體積混合的乙腈和乙酸銨溶液，收集洗脫液，乙腈定容至3 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.2.3色譜條件

色譜柱：ODS-C18、5μm、4.6mm×250mm；流動(dòng)相：乙腈+乙酸銨（80+20）；流速：1.3mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：265nm；發(fā)射波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：200 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲提取時(shí)間的比較

分別超聲5、10、15、20、25、30 min來(lái)提取水產(chǎn)品樣品中孔雀石綠和結(jié)晶紫，測(cè)回收率，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　不同萃取時(shí)間孔雀石綠的回收率比較Fig.1　Comparing different extraction time，the recovery rate of malachite green

圖2　不同萃取時(shí)間結(jié)晶紫的回收率比較Fig.2　Compare the different extraction time，the recovery rate of crystal violet

結(jié)果表明：水產(chǎn)品樣品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的回收率在15 min最高，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變化不大，因此選擇超聲提取15 min最為合適。

2.2超聲萃取與均質(zhì)萃取步驟回收率的比較

通過(guò)測(cè)定超聲萃取與均質(zhì)萃取兩個(gè)步驟的回收率情況，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　超聲萃取與均質(zhì)萃取回收率的比較Table 1　Ultrasonic extraction was compared with the homogeneous extraction recovery rate

由表1可知，超聲萃取的回收率高于均質(zhì)萃取，分析原因可能因?yàn)榫|(zhì)器上會(huì)有殘留從而導(dǎo)致回收率偏低，使用超聲節(jié)省了試驗(yàn)步驟，提高了回收率，降低了污染的可能性。

2.3萃取3次與萃取2次的回收率的比較

國(guó)標(biāo)方法在1.2.1中萃取了3次，前處理按照超聲提取后萃取2次與萃取3次進(jìn)行比較，通過(guò)比較2種方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　萃取2次與萃取3次的回收率的比較Table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

續(xù)表2　萃取2次與萃取3次的回收率的比較Continue table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

由表2可知，兩種處理步驟回收率差別不大，可以忽略不計(jì)，因此采用萃取2次可節(jié)省藥品及前處理步驟。

2.4本方法精密度試驗(yàn)

取未檢出含孔雀石綠、結(jié)晶紫，定量添加孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱性孔雀石綠和隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品后再進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)值除以實(shí)際添加值，計(jì)算回收率。具體操作如下：精密稱取空白魚(yú)肉樣品5.00 g，置于100 mL離心管中，按表3中的加標(biāo)濃度分別準(zhǔn)確加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，制成不同濃度的加標(biāo)樣品，按1.2測(cè)定方法中的提取、凈化和液相色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，每一濃度平行進(jìn)行6次試驗(yàn)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　添加不同濃度的孔雀石綠與結(jié)晶紫的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3　Adding different concentrations of malachite green and crystal violet recoveries and relative standard deviation

由表3可知，回收率在90%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～2.5%之間。

2.5本方法線性范圍及檢出限

本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范圍內(nèi)具有很好的線性，相關(guān)系數(shù)R為0.999 9，最低檢出限0.5 μg/kg。

3　討論

本方法根據(jù)國(guó)標(biāo)方法GB/T20361-2006《水產(chǎn)品孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》作了部分改進(jìn)，減少了樣品前處理時(shí)所用步驟，從而減少了孔雀石綠、結(jié)晶紫在提取過(guò)程中的損耗，減少了試劑的使用，提高了回收率，一定程度上避免了二次污染。本方法有較大的測(cè)試線性范圍和良好的精密度準(zhǔn)確度，可為各類水產(chǎn)品及其制品中孔雀石綠、結(jié)晶紫殘留的測(cè)定提供參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.044

收稿日期：2014-02-12

作者簡(jiǎn)介：孫高英（1981—），女（漢），工程師，碩士，從事食品檢驗(yàn)檢疫工作。

Determination of Malachite Green，Crystal Violet and Their Metabolites Residues in Aquatic Product by Ultrasound-assited Extraction

SUN Gao-ying，HU Li-yuan，LIAO He-jing，LIU Rui-fang，DOU Xiao-ming，HOU Fang-ni
（Guangxi Import and Export Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：This study explores the use of ultrasound-assited extraction of aquatic products of malachite green，crystal violet and HPLC fluorescence detection method，through the test to obtain the best solutions.The results showed that the ultrasound-assited extraction time is 15 min.This method has a good linear l scope between 0.5 μg/mLand800μg/mL，correlationcoefficient was0.9999，thelimitofdetectionwas0.5 μg/kg.Using different sample verification，the recovery rate is between 80%-110%，relative standard deviation（RSD）is 1%-3%.

Key words：malachite green；crystal violet；ultrasound-assited extraction