呂鴻皓，黃　莉，黨苗苗，費　楠，曹　亮，吳　磊，夏秀芳，*（.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱50030；.黑龍江省科學技術情報研究所，黑龍江哈爾濱50030）

利用大豆糖蜜制備細菌纖維素

呂鴻皓1，黃莉1，黨苗苗1，費楠1，曹亮1，吳磊2，夏秀芳1，*
（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省科學技術情報研究所，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：選用大豆糖蜜為發(fā)酵基質，利用木醋桿菌發(fā)酵制備細菌纖維素。研究糖蜜濃度、酵母浸粉添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量以及初始pH對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果表明：大豆糖蜜營養(yǎng)豐富，在大豆糖蜜濃度為15%時，在其中添加1.5%酵母浸粉、接種量為6%、初始pH4.5、30℃恒溫靜止發(fā)酵6 d后細菌纖維素合成量為1.17 g/100 mL，持水性為98.16%，復水率為292%，并利用傅里葉紅外分析表明產物為細菌纖維素。

關鍵詞：大豆糖蜜；細菌纖維素；持水性；復水率

大豆糖蜜為生產大豆?jié)饪s蛋白過程中形成的醇溶性產品，因顏色和流動性類似于蜂蜜，所以命名為糖蜜。因為糖蜜不易處理，所以多數(shù)被廢棄，不僅造成了環(huán)境的污染，而且也造成了能源的浪費[1]。以大豆糖蜜為發(fā)酵劑生產細菌纖維素不僅提高了糖蜜經(jīng)濟價值，促進了經(jīng)濟的發(fā)展，同時解決了大豆糖蜜對環(huán)境造成的污染。目前對大豆糖蜜的研究主要集中于功能性物質的提取和生物發(fā)酵劑的利用。國內主要利用大豆糖蜜提取大豆低聚糖、大豆異黃酮等功能性物質，如許浮萍[2]在其專利中采用醇沉法從大豆糖蜜中去除大豆低聚糖，再用離心法精制大豆異黃酮，產品純度達到90%以上。因為大豆糖蜜成分復雜，含有微生物生長所需要的營養(yǎng)和水溶性礦物質元素，因此是優(yōu)異的微生物發(fā)酵劑，同時大豆糖蜜價格低廉，從而降低了生產成本，因此大豆糖蜜作為微生物發(fā)酵劑的應用前景廣闊[3]。如Qureshin[4]以大豆糖蜜為原料，用Clostridium beijerinckiiBA101菌種發(fā)酵生產丁醇，開辟了生產丁醇的新途徑；Solaiman[5]采用Candida bombicola為菌種，以大豆糖蜜和油酸作為發(fā)酵原料生產槐糖脂。

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由Brown首次報道的，他發(fā)現(xiàn)木醋桿菌在靜止培養(yǎng)時在培養(yǎng)基表面會形成一層白色透明的膜，經(jīng)分析鑒定此類物質為纖維素[6]。細菌纖維素與植物纖維素化學性質相同，但細菌纖維素卻有許多獨特的性質：高純度、高彈性模量以及良好的生物適應性和生物可降解性[7]。因此，細菌纖維素成為當今研究的熱點。

本試驗以大豆糖蜜為微生物發(fā)酵的基礎原料，利用木醋桿菌生產細菌纖維素，研究發(fā)酵條件對纖維素合成量、持水性、復水率的影響。

1　材料與方法

1.1材料與菌種

大豆糖蜜：山東古谷神生物科技集團有限公司提供；酵母浸粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖：天津市天力試劑有限公司；氯化鈉：天津市光伏科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉：天津市光復科技發(fā)展有限公司。

木醋桿菌（Acetobacter Xylinum）：購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心；斜面培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%、酵母浸粉1.5%、瓊脂1.5%、pH5.5，121℃高壓滅菌15 min；種子培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%、酵母浸粉1.5%、pH5.5，121℃高壓滅菌15 min；斜面菌種的活化：從冰箱中將冷凍保存的木醋桿菌接種到新的斜面固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，斜面上會長出新的菌落；種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取一環(huán)活化好的斜面菌苔接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃靜止培養(yǎng)24 h。

1.2儀器與設備

SHENAN滅菌鍋：天津市科器高新技術公司；DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；ZHJH-1109無菌操作臺：淳美科技有限公司；pHS-25型pH計：上海精科雷磁儀器廠；AL-104型精密電子天平：上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；PG-108手持糖度計：杭州陸恒生物科技有限公司；PerKin Elmer Spectrum 100傅里葉紅外：美國鉑金埃爾默公司。

1.3方法

1.3.1大豆糖蜜的預處理

處理方法：4 500 r/min離心15 min，取上清備用。

1.3.2大豆糖蜜成分的測定

總糖的測定利用手持糖量計測定；蛋白質的測定利用雙縮脲法測定；水分的測定利用恒溫干燥法測定。

1.3.3細菌纖維素合成量

參照崔思穎[8]纖維素干質量的測定方法，并作適當?shù)男薷?，用蒸餾水沖洗細菌纖維素以除去膜表面培養(yǎng)基及雜質，用1%的NaOH溶液80℃水浴30 min，并持續(xù)用NaOH溶液浸泡至纖維素膜呈透明白色，采用醋酸中和至pH為中性，再用蒸餾水沖洗，60℃烘干至恒重并進行稱量。

1.3.4持水性的測定

參照毋銳琴[9]的方法，具體如下：常溫測定纖維素的持水性，平行稱取三個樣品，記為濕重W1，在60℃烘箱中干燥至恒重為干重W2，計算細菌纖維素膜的持水性：

1.3.4復水率的測定

將干燥好的膜放入蒸餾水中靜止24 h，取出稱纖維素膜的重量為W3，計算纖維素的復水率：

1.3.5細菌纖維素組分分析

使用傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜測試。采用溴化鉀壓片法分析細菌纖維素的紅外光譜。干燥的溴化鉀粉末與細菌纖維素粉末的用量比約為80∶1，在瑪瑙研缽中研細均勻后放入專用壓片器中以2 kg的壓力加壓制成透明的薄片。然后將此薄片放入儀器光束中進行測定（量程400 cm-1～4 000 cm-1）。

2　結果與分析

2.1大豆糖蜜成分測定結果

大豆糖蜜成分測定結果見表1。

表1　大豆糖蜜主要成分組成Table 1　Main ingredients of soy molasses

2.2糖蜜濃度的影響

在培養(yǎng)溫度25℃，發(fā)酵時間5 d，pH5.5，接種量為4%，酵母浸粉添加量1.0%的條件下，考察大豆糖蜜含量為5%、10%、15%、20%、25%對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果如圖1所示。

由圖1可以看出，隨著大豆糖蜜濃度的增加，細菌纖維的合成量、持水性和復水率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且當糖蜜濃度為15%時均達到最大值，細菌纖維素的合成量為0.18 g/100 mL，細菌纖維素的持水性和復水率分別為97.72%和419%。說明大豆糖蜜營養(yǎng)成分豐富，能夠作為木醋桿菌的發(fā)酵基質，并且所得的細菌纖維素具有較好的持水性和復水率。

圖1　糖蜜濃度對纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.1　Effect of soy molasses concentration on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

2.3酵母浸粉添加量的影響

在培養(yǎng)溫度25℃，發(fā)酵時間5 d，初始pH5.5，接種量為4%的條件下，在培養(yǎng)基中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%的酵母浸粉進行培養(yǎng)試驗，考察不同添加量的酵母浸粉對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果如圖2所示。

圖2　酵母浸粉添加量對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.2　Effect of the amount of yeast extract on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由圖2可以看出，隨著酵母浸粉添加量的增加，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且當酵母浸粉的添加量為1.5%時菌達到最大值，細菌纖維素的合成量為0.23 g/100 mL，細菌纖維素的持水性和復水率分別為97.72%和363%；與崔思穎[8]的研究基本一致，其研究酵母浸粉添加量為1.4%時，細菌纖維素的產量達到最大。

2.4初始pH的影響

在酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜濃度15%，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間5 d，接種量4%的條件下，pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著pH的增加，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當pH4.5時，細菌纖維素的合成量為0.34 g/100 mL，細菌纖維素的持水性和復水率分別為98.14%和293%，且量均為最高，趙克勤[10]等研究利用大豆酶解液制備細菌纖維素的最適pH范圍為3.5～4.0，其初始pH較低可能是因為木醋桿菌在發(fā)酵過程中會產生醋酸，較適應于酸性條件。

2.5培養(yǎng)時間的影響

在培養(yǎng)溫度25℃，酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜濃度15%，pH4.5，接種量為4%的條件下，考察4、5、6、7、8 d對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果如圖4所示。

圖3　初始pH對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.3　Effect of the initial pH on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

圖4　發(fā)酵時間對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.4　Effect of fermention time on production，water holding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的進行，前6 d細菌纖維素合成量、持水性和復水率上升較快，在發(fā)酵6 d時，細菌纖維素的合成量為0.42 g/100 mL，持水性和復水率分別為97.89%和314%，隨著發(fā)酵時間的延長，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率增長緩慢，所以確定發(fā)酵周期為6 d。湯衛(wèi)華[11]等利用木葡糖酸醋桿菌的突變株研究合成細菌纖維素的最佳發(fā)酵時間同樣為6 d。

2.6接種量的影響

在酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜濃度15%，培養(yǎng)溫度25℃，pH4.5、培養(yǎng)時間6 d的條件下，考察接種量為2%、4%、6%、8%、10%對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響，結果如圖5所示。

圖5　接種量對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.5　Effect of inoculum size on production，water holdingcapacity，rehydration of bacterial cellulose

從圖5可知，接種量2%～6%時，隨著接種量的增加，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率顯著增加，接種量6%時，細菌纖維素的合成量為1.13 g/100 mL，細菌纖維素的持水性和復水率分別為97.38%和318%，當接種量超過6%時，纖維素的合成量、持水性和復水率降低。與趙克勤[12]利用谷氨酸提取液生產細菌纖維素使用3%～4%的接種量較為接近。

2.7發(fā)酵溫度的影響

取一環(huán)活化好的斜面種子接入液體培養(yǎng)基，25℃靜止培養(yǎng)24 h，作為種子培養(yǎng)基。以6%的接種量，酵母浸粉添加量1.5%，糖蜜濃度15%，在20、25、30、35、37℃溫度條件下恒溫靜止培養(yǎng)6 d，結果如圖6所示。

圖6　發(fā)酵溫度對細菌纖維素合成量、持水性和復水率的影響Fig.6　Effect of fermention temperature on production，waterholding capacity，rehydration of bacterial cellulose

由圖6可知，發(fā)酵溫度20℃～37℃時，隨著溫度的不斷升高，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率先增加后減少，在溫度為30℃時，細菌纖維的合成量、持水性和復水率達到最大值，細菌纖維素的合成量為1.17 g/100 mL，細菌纖維素的持水性和復水率分別為98.16%和292%，當溫度高于30℃時，細菌纖維素的合成量、持水性和復水率下降；黃丹[13]等研究木醋桿菌QAX993發(fā)酵合成細菌纖維素的最適溫度同樣為30℃。

2.8細菌纖維素組分分析

利用傅里葉紅外光譜分析細菌纖維素的組分，結果如圖7所示。

圖7　BC膜的紅外光譜圖Fig.7　FT-IR spectrum of BC

在纖維素的紅外光譜中，重要表征纖維素的原子團包括有-CH2、-CH、-OH等，在3 430 cm-1處有較強的吸收峰為-OH鍵的伸縮振動，2 998 cm-1處為CH2和CH3基團的伸縮振動峰），在1 637 cm-1處為水中-OH的伸縮振動，在1 497 cm-1為-CH2對稱伸縮振動峰，在1 385 cm-1為-CH伸縮振動峰，在670 cm-1和618 cm-1為OH不對稱彎曲。由以上可知，紅外光譜上可能出現(xiàn)的有機化合物基團有-CH2、-CH、-OH等，這些基團與纖維素的分子結構式中所包含的有機化合物基團基本吻合。與沈金朋[14]等利用酒糟浸出液制備的細菌纖維素的紅外光譜圖基本一致。

3　結論

大豆糖蜜營養(yǎng)豐富，適合做木醋桿菌發(fā)酵的基本培養(yǎng)基，同時所得的細菌纖維素具有較好的持水性和復水率，即大豆糖蜜濃度為15%時，酵母浸粉添加量為1.5%、接種量為6%、初始pH4.5、30℃恒溫靜止發(fā)酵6 d后細菌纖維素合成量為1.17 g/100 mL，持水性為98.16%，復水率為292%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.044

收稿日期：2014-09-01

基金項目：國家科技支撐計劃課題（2015BAD16B00）

作者簡介：呂鴻皓（1989—），男（漢），碩士，研究方向：水產品加工及貯藏。

*通信作者：夏秀芳（1973—），女，副教授，博士，研究方向：農產品加工及貯藏。

Fermentation of Soybean Molasses for Bacterial Cellulose Preparation

Lü Hong-hao1，HUANG Li1，DANG Miao-miao1，F(xiàn)EI Nan1，CAO Liang1，WU Lei2，XIA Xiu-fang1，*
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Institute of Scientific and Technical Information of Heilongjiang，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Abstract：Bacterial cellulose（BC）was prepared from soybean molasses fermented by Acetobacter xylinum. The research explored parts of fermentation conditions on bacterial cellulose production，water holding capacity and rehydration rate as well，such as the soy molasses concentration，the amount of yeast extract，fermentation time，fermentation temperature，inoculum size and the initial pH.Results showed that the soybean molasses was rich in nutrients.The yield of BC was 1.17 g/100 mL when 15%soy molasses with the addition of 1.5%yeast extract was conducted to static fermentation at pH 4.5，6%inoculum size and 30℃for 6 days.Water holding capacity of bacterial cellulose was 98.16%，bacterial cellulose rehydration was 292%.The product was bacterial cellulose by Fourier transform infrared analysis.

Key words：soy molasses；bacterial cellulose；water holding capacity；rehydration rate