曲　莉，李瀟涵，王雪松，高麗君，艾金霞，李明成（.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林303；.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，吉林吉林303）

檢測分析

7種肉類線粒體DNA的提取及鴨源性成分檢測

曲莉1，李瀟涵2，王雪松2，高麗君2，艾金霞2，李明成2
（1.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，吉林吉林132013）

摘要：探討肉類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）提取方法，對7種生肉中的鴨肉成分進行鑒別。應(yīng)用改良鹽析法和柱層析法提取肉類mtDNA，紫外分光光度計檢測mtDNA的濃度和純度，設(shè)計鴨肉cyt b特異性引物，采用PCR對7種生肉中的鴨肉成分進行鑒別。結(jié)果：兩種提取肉類mtDNA的方法均能保證DNA的濃度及純度達到PCR的要求，柱層析法成本略高于改良鹽析法；鴨引物可以從7種生肉中鑒別出鴨源性成分，經(jīng)過多次重復(fù)試驗證明了鴨肉引物的特異性，為肉制品質(zhì)量監(jiān)控的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：改良鹽析法；柱層析法；線粒體DNA；PCR；鴨肉

近年來，肉類市場中以價格低廉的肉類摻假到價格較高肉類的欺騙行為較為常見，鴨肉作為價格低廉肉類常摻雜到牛肉、羊肉中銷售，這不僅損害了消費者的利益，更威脅了少數(shù)民族的宗教信仰。因此，建立一種快速、簡便、準確的鑒別肉類的方法十分必要。

目前，肉類品種的鑒定方法主要為蛋白質(zhì)鑒定和核酸鑒定。當(dāng)肉類經(jīng)過蒸煮、煎烤等加工后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，所以通過蛋白質(zhì)鑒定肉類品種的方法有很大的局限性。而經(jīng)過加工后核酸的結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，因此，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對肉制品的DNA檢測成為可靠的鑒定方法。Arslan A[1]研究證明，高溫的水烹調(diào)肉如烹煮、蒸烤、壓力處理等烹飪過的牛肉制品可以提取其線粒體DNA片段，而后經(jīng)PCR擴增可以鑒別出來。2013年歐洲的“馬肉風(fēng)波”引發(fā)消費者的煩感，歐盟正擬訂方案，要求所有成員國對加工牛肉開展脫氧核糖核酸（DNA）抽檢，可見肉類品種鑒定的DNA檢測為必然趨勢。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）比核DNA進化快，因此，物種間基因差異更大，且mtDNA拷貝數(shù)高（每個細胞中約1 600～6 000個拷貝），可有效降低食品加工造成的DNA損失[2]，因此在熟肉制品和飼料等的鑒別上具備獨特的優(yōu)勢。

在目的基因的選擇上，動物線粒體編碼的細胞色素b基因（cytochromeb，cytb）、12srRNA基因、16srRNA基因等均成為設(shè)計物種特異性擴增引物的良好靶標(biāo)。

本研究采用兩種方法提取肉類mtDNA，測定其濃度及純度；篩選出鴨特異性引物，可以將鴨與市場上常見肉類品種區(qū)別開來。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

采集吉林市江南菜市場新鮮的鴨、雞、豬、牛、羊、馬、驢肉（各500 g）；裂解液[10 mmol/L Tris-HCl（pH= 8.0），10 mmol/L Na2EDTA，50 mmol/L NaCl]，消化液[裂解液200 μL，0.5 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液50 μL，蛋白酶K（20 μg/mL）20 μL，RNA酶溶液5 μL]，洗脫液[5 mol/L醋酸鉀溶液26 μL，1 mol/LTris-HCl溶液（pH 7.5）18 μL，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH 8.0）3 μL，無水乙醇480 μL，滅菌雙蒸水273 μL]，十二烷基硫酸鈉SDS（10%），蛋白酶K（20 μg/mL），Taq DNA Polymerase。

H-2050R低溫高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；PCRSystem9700基因擴增儀：美國ABI公司；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠；UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀：美國Biorad公司。

1.2方法

1.2.1肉類mtDNA的提取

1.2.1.1改良鹽析法

取樣品0.5g，充分研磨備用，稱取前處理的肉類0.1g，加入500μL裂解液、30μLSDS（10%）和15μL蛋白酶K（20 μg/mL），56℃水浴震蕩過夜（約16 h～18 h）。取出加飽和乙酸鈉500μL，震蕩10 min，11 000 r/min，離心10 min。取出后取上清加入異丙醇（等體積），-20℃放置至少1 h。取出后離心11 000 r/min，10 min，棄上清，沉淀中加入70%乙醇500 μL，輕輕振蕩1 min。10 000 r/min，離心10 min。留沉淀，干燥乙醇（20 min）。加80 μL ddH2O溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.1柱層析法

取樣品0.5 g，置乳缽中，加液氮適量，充分研磨備用，取0.1 g置1.5 mL離心管中，加入消化液275 μL，在55℃水浴保溫1 h，加入裂解緩沖液250 μL，混勻，加到DNA純化柱中，離心10 000 r/min 3 min；棄去過濾液，加人洗脫液800 μL，離心10 000 r/min 1 min；棄去過濾液，用上述洗脫液反復(fù)洗脫3次，每次離心10 000 r/min 1 min；棄去過濾液，再離心2 min，將DNA純化柱轉(zhuǎn)移人另一離心管中，加入無菌雙蒸水100 μL，室溫放置2 min后，離心10 000 r/min 2 min，取上清液，作為供試品溶液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mtDNA的純度、濃度的檢測

取DNA提取液3 μL，用超微量紫外分光光度計測量260 nm和280 nm處的吸光度A260和A280，以A260/ A280的比值確定DNA的純度并計算濃度。

1.2.3mtDNA瓊脂糖凝膠電泳

將mtDNA樣品與6×上樣緩沖液（Loading Buffer）以5∶1的比例混勻后點在0.8%的瓊脂糖凝膠上，電壓為85 V～90 V，大約35 min后，經(jīng)紫外檢測并拍照。1.2.4肉類中鴨源成分PCR檢測

1.2.4.1引物設(shè)計

在GenBank中下載綠頭鴨線粒體細胞色素b （AY676201.1）基因序列，采用Primer 5.0進行設(shè)計，利用NCBI中的在線軟件Primer-BLAST對設(shè)計的引物進行評估，最后確定特異性引物序列，由上海生工生物工程公司完成合成。

上引：CTGTCCGATGTATGGGAGGGCATCGTTCTGAGGAGCTACCG

下引：AACCCTAACCCGATTCTTCGCCAGTGGAC TAGGGTGATTCCT

擴增產(chǎn)物長度：223bp

1.2.4.2PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）3 μL，dNTP 2.4 μL，DNA模板2 μL，每條引物都加1 μL，TaqDNA聚合酶2 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：將PCR產(chǎn)物與6×Loading Buffer 以5∶1的比例混勻后點在2%的瓊脂糖凝膠上，電壓為85 V～90 V，大約85 min后，經(jīng)紫外檢測拍照。

2　結(jié)果

2.17種肉類mtDNA的提取

7種肉類樣品mtDNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖1所示。

圖1　7種肉類樣品mtDNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of mtDNA in seven meat samples

由圖1可知，分別使用改良鹽析法和柱層析法提取鴨肉、雞肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉和驢肉mtDNA，結(jié)果顯示兩種方法均成功提取了7種肉類的mtDNA，由于柱層析法應(yīng)用了DNA純化柱，所以圖像更清晰。

2.2mtDNA濃度及純度

兩種方法提取7種肉類DNA的比較見表1。

表1　兩種方法提取7種肉類DNA的比較（x±s，n=6）Table 1　Comparison of two DNA extraction methods

由表2可知，改良鹽析法和柱層析法提取的mtDNA處于同一數(shù)量級，純度方面兩者相差不大，均能保證后續(xù)試驗PCR的要求。

2.3PCR鑒定結(jié)果

鴨引物對7種肉類PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2　鴨引物對7種肉類PCR鑒定結(jié)果圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of PCR in seven meat samples

通過反復(fù)梯度PCR試驗，確定最佳退火溫度為62℃。使用7種目標(biāo)肉類mtDNA為模板，對設(shè)計的鴨肉引物進行特異性驗證。由圖2可見，設(shè)計的一對鴨肉引物僅在鴨模板上，預(yù)擴增片段223 bp出現(xiàn)明顯的PCR擴增，其余6種生肉則無PCR反應(yīng)發(fā)生，證明成功建立了一種肉中鴨源性成分鑒定的PCR方法。

3　討論

鴨肉由于其價格低廉，成為市場上最常用摻假肉類之一。本研究采用兩種不同方法提取了7種生肉的mtDNA。樣品前處理均采用液氮進行研磨，避免了研磨產(chǎn)熱而導(dǎo)致的DNA鏈斷裂，保證了DNA的完整性。改良鹽析法所用試劑均為分子生物學(xué)實驗室常用試劑，除去水浴時間，只需2 h就可完成mtDNA的提取過程；柱層析法所用的試劑也均為常用試劑，提取過程在1.5 h可完成，在提取過程中需用到DNA純化柱，略增加了試驗成本。在對提取的mtDNA的濃度及純度測定的結(jié)果顯示，兩種方法提取的DNA均能達到PCR的要求，可作為PCR反應(yīng)模板，為后續(xù)試驗的順利進行奠定了基礎(chǔ)。目前，多種商品化的DNA提取試劑盒廣泛用于科研和檢驗工作中，但在大規(guī)模樣品檢測中，試劑盒存在提取時間長、成本高等不足。而本研究所采用的改良鹽析法和柱層析法提取時間短、成本低廉、DNA結(jié)構(gòu)完整，均可應(yīng)用于大樣本的DNA提取。

國內(nèi)外對肉類摻假、摻雜的研究對象主要集中在市場上常見的羊肉、牛肉、豬肉和雞肉。如侯東軍[3]以豬細胞色素b基因組為模板，設(shè)計了一對可在牛羊肉中特異并靈敏地檢測出所摻雜豬肉成分的引物，特異性擴增出130 bp的目的片段，建立了一種鑒定牛羊肉中摻雜豬肉的檢測方法。孫艷華[4-5]通過進行基因序列的比對及查閱國內(nèi)外的相關(guān)文獻，確定了市場上常見肉類豬、牛、羊、雞的特異性引物，同時對PCR法的靈敏度進行了研究，建立了判別肉制品中肉類來源的PCR法。鞏紅霞[6]提取生山羊肉和生綿羊肉的基因組DNA后，在同一反應(yīng)體系內(nèi)對生山羊肉和生綿羊肉的基因組DNA進行擴增，產(chǎn)物分別為293 bp和292 bp，應(yīng)用多重PCR方法鑒別生羊肉的真假。高琳[7]應(yīng)用PCR-RFLP法鑒別肉制品中的豬和牛源性成分。以動物mtDNA中cyt b區(qū)段的保守序列為目的基因設(shè)計通用引物，所有樣品擴增均產(chǎn)生359 bp的片段，采用Alu I限制性酶切可區(qū)分豬肉和牛肉。而目前市場常見鴨肉摻雜、摻假的現(xiàn)象。

本研究選取綠頭鴨mtDNA cyt b基因序列，在此目的基因上設(shè)計長引物進行PCR擴增。在退火溫度的確定上，經(jīng)過大量反復(fù)試驗摸索，將退火溫度定為62℃，在該溫度下，223 bp的目的基因條帶最清晰。仔細觀察PCR鑒定結(jié)果圖會發(fā)現(xiàn)，在鴨223 bp目的基因條帶上有3條非特異性擴增，考慮原因為設(shè)計的長引物不可避免會與目的模板發(fā)生非特異性擴增。但這種擴增也僅出現(xiàn)在鴨模板上，其他6種肉類均無PCR反應(yīng)，且非特異性擴增不影響目的基因的位置和清晰度，故可以忽略不計。該引物僅針對鴨模板發(fā)生了PCR擴增，而其余6種生肉模板均無PCR反應(yīng)發(fā)生，顯示了引物非常好的特異性?？蓾M足一般實驗室肉類品種鑒定，并可為質(zhì)檢部門推廣應(yīng)用。

本研究是國內(nèi)首次設(shè)計長引物，通過比較不同肉類mtDNA序列差異進行鴨源性成分鑒別的研究。相比于目前常見的多重PCR、PCR-RFLP方法，本方法反應(yīng)體系更簡單，且檢測結(jié)果可靠，所有試劑、儀器在分子生物學(xué)實驗室均常見，成本低廉，檢測時間短，結(jié)果準確。在后續(xù)工作中，可針對加工肉制品如香腸、火腿、速凍水餃中的肉類組分進行分析；也可應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進一步開發(fā)不同肉類組分的定量檢測。

下一步需要驗證PCR方法的敏感性，以期將該方法應(yīng)用于純?nèi)?、肉卷、肉丸等肉類的檢測工作。

參考文獻：

[1]Arslan A,Ilhak O I,Calicioglu M.Effect of method of cooking on identification of heat processed beef using polymerase chain reaction (PCR)technique[J].Meat Science,2006,72(2):326-330

[2]李文靜.分子學(xué)方法鑒定肉制品種屬來源的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊,2009,36(3):151-158

[3]侯東軍,楊紅菊,姜艷彬,等.PCR鑒定牛羊肉中摻雜豬肉的方法建立[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):328-330

[4]孫艷華,張智禹,牛晉陽,等.PCR法檢測肉制品中肉類來源的靈敏度研究[J].食品工業(yè),2010(3):93-94

[5]孫艷華,張智禹,牛晉陽,等.PCR法快速檢測熟肉制品中肉類來源[J].食品研究與開發(fā),2010,31(5):139-142

[6]鞏紅霞,任永宏,鞏強.用多重PCR方法鑒別生羊肉的真假[J].中國畜牧獸醫(yī),2006,33(8):38

[7]高琳,徐幸蓮,周光宏.應(yīng)用PCR-RFLP法鑒別肉制品中的豬和牛源性成分[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,31(2):135-138

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.029

收稿日期：2015-03-12

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目（20140307008YY）

作者簡介：曲莉（1978—），女（漢），講師，碩士，研究方向:食品分子鑒定。

Extraction of Mitochondrial DNA in Seven Kinds Meat and Detection of Duck Meat Composition

QU Li1，LI Xiao-han2，WANG Xue-song2，GAO Li-jun2，AI Jin-xia2，LI Ming-cheng2
（1.College of Public Health，Beihua University，Jilin 132013，Jilin，China；2.College of Laboratory Medicine，Beihua University，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：Two methods were used to extract the mtDNA in meat，the best method was determined through comparing the concentration and purity of mtDNA.The specific primers of duck cyt b was designed to identify the most common adulterated meat on the market，duck compositions were identified in 7 kinds of raw meat by PCR technology.The results show that the two methods of extracting meat mtDNA can achieve the requirement of the PCR in the concentration and purity of DNA.The cost of column chromatography was higher than the improved salting out method.Duck source composition can be identified from 7 kinds of raw meat by duck primer，the specificity of the duck primers was proved through the repeating experiment.This test provides the experimental basis for the application for the meat products quality monitoring.

Key words：improved salt fractionation；column chromatograph；mitochondrial DNA；PCR；duck