廖日權(quán)，鐘秋平，許蘭仙（.欽州學(xué)院海洋學(xué)院，廣西欽州535000；.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川7500）

椆樹(shù)桑寄生多糖提取工藝優(yōu)化

廖日權(quán)1，鐘秋平1，許蘭仙2
（1.欽州學(xué)院海洋學(xué)院，廣西欽州535000；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

摘要：以椆樹(shù)桑寄生樹(shù)葉為原料，對(duì)植物多糖提取的影響因素及工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。采用熱水浸提方法，分析提取溫度、時(shí)間、料液比和醇降濃度對(duì)提取椆樹(shù)桑寄生植物多糖的影響。采用硫酸-苯酚法測(cè)定椆樹(shù)桑寄生植物多糖，根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化確定椆樹(shù)桑寄生多糖最優(yōu)提取條件為：提取溫度為80℃、料液比為1∶20（g/mL）、提取時(shí)間為2.0 h，乙醇醇降濃度為70%。在此條件下，椆樹(shù)桑寄生多糖提取率為1.7%。

關(guān)鍵詞：椆樹(shù)桑寄生；多糖；提取工藝；正交試驗(yàn)

椆樹(shù)桑寄生（Loranthus delavayiVan TieghDanser）又名廣寄生、寄生茶，為桑寄生科鈍果寄生屬植物，可寄生于海拔500 m～3 000 m山谷、山地常綠闊葉林中，常寄生于殼斗科植物上。我國(guó)主要分布于西藏（察隅）、云南、廣西、福建等地[1]。該藥材味苦、甘，性微溫，功效主治為祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、續(xù)骨，主治風(fēng)濕痹證、腰膝疼痛、骨折[2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從椆樹(shù)桑寄生科植物的提取物中分離到多種化學(xué)成分，研究表明該植物多種成分具有抗腫瘤等活性[3-6]。

同時(shí)，許多植物多糖具有生物活性，它們具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護(hù)肝臟等保健作用[7-10]。但到目前為止，通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有學(xué)者對(duì)椆樹(shù)桑寄生植物多糖提取工藝進(jìn)行研究。因此本研究以廣西河池地區(qū)的椆樹(shù)桑寄生樹(shù)葉為研究對(duì)象，以水溶性多糖得率為指標(biāo)，對(duì)椆樹(shù)桑寄生植物多糖的提取工藝進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究，探討其植物多糖提取最佳工藝條件，為開(kāi)發(fā)廣西的椆樹(shù)桑寄生資源提供科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

椆樹(shù)桑寄生植物1 000 g，采摘于廣西河池市，由欽州學(xué)院鐘秋平副教授鑒定。

1.1.2試劑

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇、氯仿、正丁醇，所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器

BL610型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取椆樹(shù)桑寄生樹(shù)葉干粉100 g，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水1 000 mL，80℃水浴浸提120 min，抽濾；濾渣重復(fù)提取兩次，合并3次濾液，過(guò)濾，沉淀，4 000 r/min離心10 min，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮，然后向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，沉淀10 h，再3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，有機(jī)溶劑洗滌沉淀兩次，真空干燥沉淀物，得椆樹(shù)桑寄生粗多糖。

將干燥的椆樹(shù)桑寄生粗多糖用蒸餾水溶解，活性炭75℃水浴100 min，間歇攪拌，4 000 r/min離心10 min，上清液中加入2.4倍體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩后靜置30 min，4 000 r/min離心10min，取上清液，減壓蒸餾濃縮，95%乙醇醇析，提取到椆樹(shù)桑寄生多糖沉淀，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌2次～3次，真空干燥后得精制樹(shù)桑寄生多糖多糖備用。

1.2.2苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量

1.2.2.1測(cè)定波長(zhǎng)的確定

配制一定濃度的椆樹(shù)桑寄生植物多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取1.0 mL于石英比色皿中，根據(jù)多糖與苯酚-濃硫酸試劑發(fā)生特異性反應(yīng)[10]，以等量的蒸餾水作空白，在UV-3200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上從400 nm～700 nm進(jìn)行掃描，確定椆樹(shù)桑寄生植物多糖和葡萄糖的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將葡萄糖配制成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用苯酚-硫酸法于490 nm處測(cè)量吸光度。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=3.538 9C-0.006 2（R2=0.999 3）。

1.2.2.3換算因子的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重椆樹(shù)桑寄生多糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，作為多糖儲(chǔ)備液。吸取0.2 mL，加水至1 mL。按1.2.2.2步驟測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。按照如下公式計(jì)算換算因子f。

式中：W為椆樹(shù)桑寄生多糖的質(zhì)量，mg；C為椆樹(shù)桑寄生多糖溶液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為稀釋因子，mL。取3次測(cè)量平均值，計(jì)算得f=2.35。

1.2.2.4苯酚-硫酸法計(jì)算多糖提取率

按照1.2.6中步驟，將沉淀的多糖用蒸餾水溶解后定容，按1.2.2.2步驟測(cè)其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與換算因子計(jì)算椆樹(shù)桑寄生葉多糖提取率。

椆樹(shù)桑寄生多糖提取率（%）=C×D f/W×100

式中：C為椆樹(shù)桑寄生多糖溶液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為稀釋因子，mL；f為換算因子；W為椆樹(shù)桑寄生樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4影響多糖提取效果的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取椆樹(shù)桑寄生葉干粉1.00 g，置于比色管中，加入一定體積蒸餾水，水浴加熱浸提一定時(shí)間，提取液減壓過(guò)濾，濾渣重復(fù)浸提步驟3次；合并濾液，減壓蒸餾，濃縮液醇沉得多糖，多糖經(jīng)蒸餾水溶解、定容，測(cè)定椆樹(shù)桑寄生多糖含量并計(jì)算提取率。分別以提取溫度、提取時(shí)間、料液比和醇降濃度4個(gè)因素為對(duì)象，考察其對(duì)椆樹(shù)桑寄生多糖提取率的影響。

1.2.5椆樹(shù)桑寄生多糖提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度四因素三水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化多糖的提取工藝。水平表見(jiàn)表1。

表1　椆樹(shù)桑寄生植物多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of orthofonal test of polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

1.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，精密稱(chēng)取1.0 g椆樹(shù)桑寄生葉粉末，在1.2.5確定的工藝條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，驗(yàn)證所提取條件優(yōu)化的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果

2.1單因素的優(yōu)化

2.1.1醇降濃度對(duì)多糖提取效果的影響

醇降濃度對(duì)多糖提取效果的影響見(jiàn)圖1所示。

圖1　乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1　The effect of alcohol concentration on polysaccharide extraction rate

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，多糖提取率增大，濃度在70%時(shí)，提取效果最好；隨后，多糖提取率隨乙醇濃度的增加，多糖提取率下降。

2.1.2料液比對(duì)多糖提取效果的影響

料液比對(duì)多糖提取效果的影響見(jiàn)圖2所示。

由圖2可知，隨著液料比減小，多糖提取率首先增加，在液料比為1∶20（g/mL）時(shí)，多糖提取率最大；過(guò)了1∶20（g/mL）多糖提取率呈下降的趨勢(shì)。

2.1.3提取溫度對(duì)多糖提取效果的影響

提取溫度對(duì)多糖提取效果的影響見(jiàn)圖3所示。

圖2　料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2　The effect of solid-liquid ratioe on polysaccharide extraction rate

圖3　提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3　The effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

由圖3可知，隨著提取溫度的提高多糖提取率增加，溫度在80℃時(shí)，提取效果最好；隨后，多糖提取率隨提取溫度的升高而降低。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響見(jiàn)圖4所示。

圖4　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4　The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

圖4可知，多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)時(shí)間超過(guò)2 h后，提取率呈下降趨勢(shì)。試驗(yàn)表明2 h時(shí)為最佳提取時(shí)間，提取效果最好。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比和醇降濃度為考察因素，各取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表（表1），對(duì)椆樹(shù)桑寄生多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　椆樹(shù)桑寄生多糖提取工藝優(yōu)化L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　The results of orthofonal test on polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

由極差R值可知，各考察因素對(duì)椆樹(shù)桑寄生多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞醇降濃度。從K值來(lái)看，A因素列極差K2＞K3＞K1，B因素列極差K2＞K3＞K1，C因素列極差K2＞K1＞K3，D因素列極差K1＞K3＞K2，因此確定椆樹(shù)桑寄生植物多糖法水提醇降法最佳提取工藝條件為：A2B2C2D1，即提取溫度80℃，提取時(shí)間2.0 h，料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度為70%。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，精密稱(chēng)取1.0 g椆樹(shù)桑寄生植物粉末，在上述確定的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，測(cè)提取多糖提取率分別為1.66%、1.73%和1.72%，平均值約為1.7%。試驗(yàn)表明，此工藝穩(wěn)定、重復(fù)性較好。

3　結(jié)論

利用水提醇降法提取多糖具有能耗低、省時(shí)、不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)，該工藝合理、成熟，有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交試驗(yàn)，試驗(yàn)提取出各因素對(duì)椆樹(shù)桑寄生多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞醇降濃度。確定椆樹(shù)桑寄生植物多糖法水提醇降法提取多糖最佳工藝條件為：提取溫度80℃，提取時(shí)間2 h，料液比1∶20（g/mL），醇降濃度為70%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.012

收稿日期：2014-11-20

基金項(xiàng)目：欽州學(xué)院科研項(xiàng)目（2013XJKY-10B）；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KY2015LX537）

作者簡(jiǎn)介：廖日權(quán)（1982—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，主要從事海洋藥物及海洋環(huán)境化學(xué)研究。

The Extraction Process of Polysaccharide from Loranthus delavayiVan Tiegh

LIAO Ri-quan1，ZHONG Qiu-ping1，XU Lan-xian2
（1.Marine School of Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China；2.School of Biological Sciences and Engineering of Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：The polysaccharide was extracted from the leaf of Loranthus delavayiVan TieghDanserp in Guangxi，and the extraction process was studied by single factor and orthogonal experiment.With water as extraction solvent，the effect of extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio and alcohol concentration on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by four factor-four level orthogonal experiment.The result showed that the optimal extraction conditions of polysaccharide were：the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL），the extraction time was 2 h and the alcohol concentration was 70%.Under these conditions the polysaccharide extraction yield was 1.7%.

Key words：Loranthus delavayiVan Tiegh，polysaccharide，extraction process，orthogonal experiment