朱林江，李崎

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工業(yè)微生物基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展

朱林江1,2，李崎1,2

1江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122 2江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無(wú)錫 214122

朱林江, 李崎. 工業(yè)微生物基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 338–350.Zhu LJ, Li Q. Genome editing of industrial microorganism. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 338–350.

近年來(lái)，基因組范圍的高效編輯技術(shù)發(fā)展迅速，對(duì)工業(yè)微生物基因組的改造效率不斷提升，徹底改變了以“一次操作、一個(gè)抗性基因、一個(gè)修飾位點(diǎn)”為特征的傳統(tǒng)遺傳操作模式，實(shí)現(xiàn)了基因組上多重位點(diǎn)的同步編輯，精確高效且無(wú)需抗生素輔助的插入替換或刪除，以及大片段基因組DNA的剪切-粘貼等。這些技術(shù)的應(yīng)用，能夠高效構(gòu)建優(yōu)良性能的生產(chǎn)菌株，必將推動(dòng)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的革新，促進(jìn)以新能源和新材料為基礎(chǔ)的新型工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展。本文針對(duì)這些新技術(shù)的原理和特點(diǎn)，結(jié)合一些典型應(yīng)用實(shí)例，進(jìn)行分析和總結(jié)，希望能為工業(yè)微生物的改造與構(gòu)建提供參考與借鑒。

基因組編輯，寡核苷酸介導(dǎo)的重組，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，二型內(nèi)含子，進(jìn)化工程

近十幾年來(lái)，生物技術(shù)迅猛發(fā)展，如高通量的基因組測(cè)序技術(shù)不斷更新?lián)Q代；基因組信息的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)；高通量分析工具的不斷改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞代謝活性實(shí)時(shí)定量分析；新型高效的遺傳工具和日趨完善的生物信息學(xué)分析方法等不斷出現(xiàn)，助推了工業(yè)微生物育種技術(shù)的飛躍式發(fā)展[1]。目前，許多工業(yè)微生物的育種，不再依賴于過(guò)去的模式，如特征表型菌株的篩選、誘變育種和低效的遺傳操作技術(shù)，而是通過(guò)高效的基因組工程改造技術(shù)，如對(duì)現(xiàn)有菌株的基因組進(jìn)行人為設(shè)計(jì)并高效修飾、重組、優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建新型的工業(yè)微生物，高效地制備各種化合物，如甲烷、乙醇、乳酸、丙烯酸、1,3-丙二醇、丁二酸、正丁醇、異丁醇以及1,4-丁二醇等[2]。這些基因組工程技術(shù)，改變了以“一次操作、一個(gè)抗性基因、一個(gè)修飾位點(diǎn)”為特征的繁瑣遺傳操作模式，以及以“一次改造、一條途徑、一個(gè)關(guān)鍵基因”為特征的低效途徑優(yōu)化策略，而是實(shí)現(xiàn)了在基因組尺度的多重位點(diǎn)和多重途徑的組合優(yōu)化，即基因組編輯 (Genome editing)。

所謂的基因組編輯，是在基因組尺度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效設(shè)計(jì)與高效改造，如基因組上多個(gè)位點(diǎn)同步插入或刪除實(shí)現(xiàn)多個(gè)代謝分支途徑的組合優(yōu)化[3]和外源代謝路徑的大片段基因組整合實(shí)現(xiàn)全新代謝能力的改造[4]等。這種基因組尺度的高效編輯技術(shù)主要包括對(duì)基因組上多重位點(diǎn)進(jìn)行同步改寫(xiě)、高效的插入、替換或刪除、大片段的剪切-粘貼以及自主編輯 (即基因組程序性進(jìn)化) 等。這些技術(shù)的應(yīng)用，哈佛醫(yī)學(xué)院的Church教授進(jìn)行了形象的比喻，稱為對(duì)基因組這一密碼文本進(jìn)行的“文本”編輯 (Writing)[5]，這體現(xiàn)了人工隨意性以及高效性地改造工業(yè)微生物基因組時(shí)代的到來(lái)。

1 基因組多重位點(diǎn)的同步編輯技術(shù)

基因組上多重位點(diǎn)的同步編輯對(duì)工業(yè)微生物代謝性能的改造具有重要意義，比如組合調(diào)控多個(gè)酶的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)分支路徑弱化與主代謝路徑強(qiáng)化的同步等，克服多重代謝通量?jī)?yōu)化的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)改造的困難。近幾年，不斷完善了這種高效的多重基因同步編輯技術(shù)，能在基因組范圍內(nèi)對(duì)任意的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同步修飾[3,6]，比如多個(gè)基因的RBS序列的修改、基因啟動(dòng)子的同步替換、多個(gè)基因的同步失活或刪除等等。

1.1 寡核苷酸介導(dǎo)的基因組多重位點(diǎn)編輯技術(shù)

基因組的多重位點(diǎn)同步編輯技術(shù)首先在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)，即基于l-Red重組蛋白Beta的基因組多重位點(diǎn)自動(dòng)改造技術(shù)(Multiplex automated genome engineering，MAGE)[3]。該技術(shù)的基本原理是利用人工高效合成的寡核苷酸鏈 (ssDNA)，在噬菌體重組酶介導(dǎo)下，通過(guò)同源臂退火到復(fù)制叉上單鏈DNA的目標(biāo)位點(diǎn)，利用DNA復(fù)制過(guò)程對(duì)基因組進(jìn)行編輯。多種ssDNA的引入，則實(shí)現(xiàn)多重編輯。由于編輯過(guò)程可反復(fù)循環(huán)，不斷積累編輯的細(xì)胞，最終達(dá)到較高的編輯效率，而無(wú)需抗生素輔助的篩選過(guò)程。這一技術(shù)最早源自于中的線性雙鏈DNA高效整合基因組技術(shù)[7-8]，如圖1A所示。將攜帶有抗性基因和同源臂的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中時(shí)，噬菌體重組酶 (包括l噬菌體來(lái)源的Exo/Beta/Gam三種Red蛋白；或Rac噬菌體來(lái)源的RecE/RecT) 能夠輔助線性DNA整合到基因組同源位點(diǎn)，通過(guò)抗性篩選得到突變菌株。不過(guò)，該方法一次操作，只能修飾一個(gè)基因，且需要抗性篩選，基因組編輯效率較低。后來(lái)，對(duì)這種噬菌體重組蛋白介導(dǎo)的同源重組的分子機(jī)制進(jìn)行了解析，并革新了這一基因組修飾技術(shù)。將含有抗性基因的較長(zhǎng)線性雙鏈DNA簡(jiǎn)化為幾十個(gè)堿基組成的ssDNA，且多種ssDNA同時(shí)轉(zhuǎn)化，可實(shí)現(xiàn)多重基因同步編輯。

這種ssDNA介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)如圖1B所示，其基本步驟是：將人工合成的多種ssDNA混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，與胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)Beta蛋白結(jié)合，防止被降解；同時(shí)Beta蛋白協(xié)助其侵入到基因組復(fù)制叉滯后鏈上的同源位點(diǎn)；ssDNA上的同源臂互補(bǔ)退火后被作為引物合成新生DNA，從而引入突變；主要的突變形式包括點(diǎn)突變和少數(shù)堿基的替換、基因插入和基因刪除。該方法的典型應(yīng)用例子是，在中對(duì)番茄紅素合成途徑中的24個(gè)關(guān)鍵基因的同步優(yōu)化[3]。通過(guò)多次轉(zhuǎn)化-培養(yǎng)-轉(zhuǎn)化的循環(huán)程序，實(shí)現(xiàn)了20個(gè)基因的RBS序列的隨機(jī)修改和4個(gè)基因刪除的組合優(yōu)化，顯著提高產(chǎn)物番茄紅素的積累。近幾年，由于該方法的高效和通用性，其應(yīng)用領(lǐng)域被迅速拓展，除了易于遺傳轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、結(jié)核桿菌[9]、鼠傷寒沙門(mén)菌、弗氏痢疾桿菌和丁香假單胞菌[10]之外，在轉(zhuǎn)化效率和同源重組頻率均偏低的革蘭氏陽(yáng)性菌中也都已被應(yīng)用，包括枯草芽胞桿菌[11]、羅氏乳桿菌、植物乳桿菌、加氏乳桿菌、乳酸乳球菌[12]以及谷氨酸棒桿菌[13]等。此外，這種ssDNA修飾基因組的方法在真核細(xì)胞中也已得到應(yīng)用，包括釀酒酵母[14]和人體細(xì)胞。所以，這種高效的基因組修飾技術(shù)必將在未來(lái)工業(yè)微生物的改造中發(fā)揮重要的作用。

1.2 選擇標(biāo)記輔助的多重位點(diǎn)編輯技術(shù)

ssDNA介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)雖簡(jiǎn)單高效，但每個(gè)位點(diǎn)被改造的堿基數(shù)量有限，且篩選過(guò)程受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率影響較大。為了進(jìn)一步提高基因組的編輯效率，研究人員新開(kāi)發(fā)了一種有選擇標(biāo)記輔助的MAGE技術(shù) (CoS-MAGE)[6]。該方法在基因組上預(yù)先引入一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記的突變基因，通過(guò)MAGE同步回復(fù)該突變基因作為選擇標(biāo)記，從而篩選到含有其他位點(diǎn)被同步編輯的菌株。這是利用ssDNA在復(fù)制叉附近發(fā)生多位點(diǎn)同步共編輯的原理，即當(dāng)細(xì)胞處于某個(gè)特定復(fù)制狀態(tài)，目標(biāo)位點(diǎn)被修飾，此時(shí)該位點(diǎn)上下游區(qū)域發(fā)生ssDNA重組事件概率也顯著性增強(qiáng)，表現(xiàn)為共修飾現(xiàn)象。利用這種機(jī)制，當(dāng)選擇標(biāo)記基因被ssDNA回復(fù)突變時(shí)，距離該位點(diǎn)上下游約500 kb的區(qū)域內(nèi)，被同源ssDNA編輯的效率顯著提高，一次可實(shí)現(xiàn)7–9個(gè)位點(diǎn)的同步編輯，且每一個(gè)位點(diǎn)的編輯長(zhǎng)度也顯著增加，比如啟動(dòng)子的替換。所以，CoS-MAGE能夠顯著性地提高M(jìn)AGE的效率[15]。此外，由于多個(gè)位點(diǎn)的編輯存在一定的概率，在CoS-MAGE的篩選過(guò)程中，可同時(shí)篩選到不同組合位點(diǎn)被編輯的菌株，從而能夠比較不同基因的強(qiáng)弱表達(dá)對(duì)產(chǎn)物積累的影響[6]。另一種提高M(jìn)AGE的效率是減弱細(xì)胞對(duì)ssDNA的降解能力，同時(shí)干擾DNA復(fù)制過(guò)程，增加岡崎片段的長(zhǎng)度，從而提高ssDNA修飾效率，該方法也能夠進(jìn)一步提高CoS-MAGE的效率[16]。

圖1 噬菌體重組酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)

2 雙鏈斷裂介導(dǎo)的高效插入、替換和刪除

基因組高效編輯技術(shù)的另一種策略是，通過(guò)自定義人工核酸酶，精確識(shí)別并切割基因組特定位點(diǎn)，形成雙鏈斷裂，通過(guò)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因組的編輯。在真核微生物中，雙鏈斷裂的DNA修復(fù)方式主要包括非同源末端連接 (Non-homologous end-joining，NHEJ) 和同源重組 (Homologous recombination，HR)。其中，NHEJ的方式能夠在斷裂之處插入或刪除少量堿基，其修飾結(jié)果是不可控的，適用于特定基因的滅活；而HR的方式則需引入外源同源DNA，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)位點(diǎn)的精確修飾，包括DNA片段的插入、刪除和替換，不過(guò)其精確性受NHEJ修復(fù)方式一定的干擾[17]。由于基因組的雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞毒性較大，所以這種DNA雙鏈斷裂介導(dǎo)的基因組編輯效率較高，無(wú)需抗生素輔助篩選。不過(guò)，這種基因組編輯的操作效率，與人工核酸酶識(shí)別DNA序列的改造效率密切相關(guān)。近幾年，這種技術(shù)已得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，革新速度幾乎趕超了計(jì)算機(jī)科技的發(fā)展速度，成為了生物科學(xué)發(fā)展的熱點(diǎn)問(wèn)題。這主要是由于新型核酸酶開(kāi)發(fā)和利用，包括鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFNs)，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，歸巢核酸內(nèi)切酶 (Engineered meganucleases) 以及CRISPR-Cas系統(tǒng) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR-associated system)。

2.1 ZFNs的基因組編輯技術(shù)

ZFNs介導(dǎo)的基因組編輯，主要依賴于具備專一性識(shí)別DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)域 (ZF) 和特異性低的內(nèi)切核酸酶Ⅰ，如圖2A所示。ZFNs識(shí)別并切割基因組上的特異性位點(diǎn)，形成雙鏈斷裂，極大增加了該位點(diǎn)的重組修復(fù)頻率，包括非同源末端鏈接和同源重組，促使切割位點(diǎn)突變產(chǎn)生或?qū)⑼庠匆氲腄NA片段通過(guò)同源重組整合到切割位點(diǎn)。該方法的高效性取決于具有專一性識(shí)別DNA位點(diǎn)能力的鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建。該結(jié)構(gòu)域由多個(gè)鋅指組成，每一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域含約30個(gè)氨基酸，識(shí)別3個(gè)堿基對(duì)序列，不同鋅指組裝可識(shí)別不同的序列。針對(duì)基因組上某一特定基因，需要選擇的合適序列，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別的ZF，構(gòu)建和驗(yàn)證ZF與Ⅰ連接產(chǎn)物ZFN的活性，最后用于目標(biāo)基因的修飾。然而，鋅指結(jié)構(gòu)域并不能隨機(jī)組裝，必須借助多種設(shè)計(jì)方法以及選擇優(yōu)化等[18]，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力；許多被改造的鋅指結(jié)構(gòu)域的特異性不高，容易產(chǎn)生脫靶切割。所以，ZFNs在全基因組范圍的隨機(jī)編輯存在一定的局限性。

圖2 雙鏈斷裂介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)

2.2 TALENs介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)

TALE核酸酶技術(shù)于2009年開(kāi)始被報(bào)道，由于其能夠克服鋅指核酸酶設(shè)計(jì)上的困難而被廣泛關(guān)注，在2012年底被期刊評(píng)為年度十大突破性技術(shù)。該技術(shù)的原理是依賴于改造的TALE核酸酶對(duì)基因組上特異性位點(diǎn)的識(shí)別與切割，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的位點(diǎn)的修飾，如圖2B所示。天然的TALE蛋白是來(lái)源于植物病原菌的一種轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白，包含有特殊DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)TALE蛋白的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域由5–30個(gè)重復(fù)單元串聯(lián)而成；一般每個(gè)單元由34個(gè)氨基酸組成，且高度保守，只有第12和13位的氨基酸高度可變；這些串聯(lián)的重復(fù)單元形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)用于識(shí)別DNA，且每個(gè)重復(fù)單元識(shí)別一個(gè)堿基，由第12和13位的氨基酸決定識(shí)別的堿基。由于1個(gè)重復(fù)單元識(shí)別單個(gè)堿基，而且不同單元的串聯(lián)組裝對(duì)整個(gè)結(jié)構(gòu)域的活性影響較小，所以幾乎可隨機(jī)組裝，具有很高的適用性。應(yīng)用高效的組裝方法，根據(jù)目標(biāo)DNA序列，自定義組裝重復(fù)單元，從而極大提升TALE蛋白的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)與改造。將TALE蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域替換為非專一性內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域 (Ⅰ)，將其改造為T(mén)ALE核酸酶，用于基因組編輯。由于Ⅰ的內(nèi)切核酸酶活性是以二聚體的形式存在，需要構(gòu)建一對(duì)識(shí)別比鄰DNA的TALE核酸酶，其識(shí)別的長(zhǎng)度一般是14–20 bp[17]。TALENs編輯基因組的編輯效率往往與這些DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域重復(fù)單元的組裝效率密切相關(guān)，目前已有多個(gè)研究組構(gòu)建了一些通用的載體和在線的設(shè)計(jì)軟件[19-20]，以及基于磁珠的高通量自動(dòng)化組裝方法[21]，使TALENs的效率被不斷提升。除了在多細(xì)胞真核生物被廣泛應(yīng)用外[17]，該技術(shù)也已被應(yīng)用于酵母細(xì)胞基因組高效精確的編輯[22]。應(yīng)用來(lái)自水稻黃單胞菌TALE蛋白AvrXa7的4種堿基識(shí)別單元，經(jīng)過(guò)PCR結(jié)合BⅠ酶切的組裝方法進(jìn)行模塊化組裝，構(gòu)建了10個(gè)可識(shí)別17–23 bp特異性序列的不同TALENs，用于修飾酵母基因組上3個(gè)基因的5個(gè)不同位點(diǎn)的編輯。結(jié)果證實(shí)，這些基因位點(diǎn)均被高效修飾，其中通過(guò)NHEJ方式的編輯效率在10–4–10–2之間，以基因缺失 (1–70 bp) 造成移碼突變?yōu)橹?；若引入外源同源片段，以HR方式進(jìn)行精確編輯，包括特異性插入失活和基因替換，其效率可提高近100倍，最高的編輯效率達(dá)到34%。

2.3 CRISPR-Cas介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)

CRISPR-Cas介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是在2013年初才出現(xiàn)，隨即被認(rèn)為是新一代的基因組編輯技術(shù)。與TALE核酸酶相比，CRISPR-Cas系統(tǒng)則更加簡(jiǎn)單方便，易于操作和拓展。CRISPR-Cas系統(tǒng)是許多細(xì)菌和古菌都具有的一種防御外源DNA (噬菌體和質(zhì)粒等) 入侵的原核生物免疫系統(tǒng)。其原理是由CRISPR RNA (crRNA) 識(shí)別外源DNA，并被Cas核酸酶切割，所以這是一個(gè)由crRNA介導(dǎo)的特異DNA切割系統(tǒng)，如圖2C所示。細(xì)菌的Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)僅含有單個(gè)基因編碼的Cas核酸酶Cas9，該蛋白同時(shí)具備了crRNA的成熟、特異位點(diǎn)的識(shí)別和DNA雙鏈切割的功能，因該系統(tǒng)易于操作而被改造為基因組編輯工具。在天然宿主細(xì)胞中，crRNA的成熟需要tracrRNA (trans-acting crRNA) 和RNaseⅢ的輔助，成熟的crRNA與tracrRNA的形成雙鏈RNA后，再與Cas9相互作用形成復(fù)合物。此復(fù)合物在crRNA上特異序列的指導(dǎo)下，識(shí)別特異DNA并在識(shí)別位點(diǎn)毗鄰的PAM序列之處 (3–9 bp) 進(jìn)行切割，形成雙鏈斷裂。在基因組編輯過(guò)程中，這種雙鏈斷裂之處同樣地可經(jīng)胞內(nèi)的兩種修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，包括NHEJ和由外源含同源臂DNA輔助的HR，從而實(shí)現(xiàn)基因堿基修飾、基因失活、基因刪除以及大片段DNA的缺失等[23]。由于crRNA的序列可隨意編輯，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)被認(rèn)為適用于基因組上任意位點(diǎn)的精確編輯。

在實(shí)際應(yīng)用中，crRNA與tracrRNA形成的雙鏈可以采用人工設(shè)計(jì)的gRNA (Guide RNA) 取代 (圖2C)，gRNA自主折疊形成Cas9可識(shí)別的雙鏈RNA，簡(jiǎn)化了CRISPR-Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)已被應(yīng)用于細(xì)菌[24]、酵母[25]、植物、線蟲(chóng)、石斑魚(yú)、老鼠以及人的細(xì)胞等。其中在釀酒酵母中，采用人工設(shè)計(jì)的gRNA，在Cas9的輔助下，基因組的定點(diǎn)突變和同源基因替換的效率接近100%，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、高效、精確的基因組編輯[25]。除了對(duì)基因組DNA定點(diǎn)編輯之外，通過(guò)對(duì)Cas9的改造，消除其核酸內(nèi)切酶的活性 (dCas9)，改造的CRISPR-dCas9系統(tǒng)可應(yīng)用于單個(gè)或多重基因的表達(dá)調(diào)控，包括細(xì)菌和真核生物[26-27]。其原理是：1) 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)gRNA后，使其與dCas9形成復(fù)合物，識(shí)別目標(biāo)基因但不發(fā)生雙鏈切割，可阻止該基因的轉(zhuǎn)錄延伸、核糖體結(jié)合或是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使基因表達(dá)水平顯著下降，一些基因的轉(zhuǎn)錄水平甚至下降至原來(lái)的10–4水平，幾乎沉默該基因的表達(dá)[27]；2) 在dCas9蛋白上融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或抑制結(jié)構(gòu)域，由表達(dá)的gRNA精確引導(dǎo)，使其結(jié)合到目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且精確地調(diào)控基因表達(dá)[26]。通過(guò)引入多重gRNA，可實(shí)現(xiàn)多重基因的表達(dá)調(diào)控，具有簡(jiǎn)單、高效和精確的特點(diǎn)[27]。

3 基因組大片段的插入、刪除和剪切- 粘貼

在基因組范圍進(jìn)行自定義編輯，大片段基因的操作是必不可少的，比如一整條次級(jí)代謝途徑的整合、一些非必需基因的大片段刪除等。盡管自定義人工合成基因組是最簡(jiǎn)單直接的，但是其成本太高，難以被推廣應(yīng)用。在現(xiàn)有基因組的基礎(chǔ)上，采用低成本的大片段合成DNA，并進(jìn)行自定義改造則更容易操作，可提高基因組大片段編輯的效率。這種大片段DNA插入或刪除技術(shù)主要是由位點(diǎn)專一的重組酶和它的特異性識(shí)別位點(diǎn)組成，包括最早被識(shí)別的l噬菌體溶源性基因組整合系統(tǒng)：整合酶和專一性位點(diǎn) (自身基因組上的位點(diǎn)和宿主基因組上的位點(diǎn))；P1噬菌體的Cre/重組系統(tǒng)；酵母的Flp/FRT重組系統(tǒng)等。

3.1 位點(diǎn)專一性重組酶的基因組編輯

應(yīng)用這些重組酶進(jìn)行基因組編輯，其原理是在基因組上和目的DNA上均插入特異性識(shí)別序列，在相應(yīng)的重組酶作用下進(jìn)行重組，實(shí)現(xiàn)大片段DNA的插入、刪除或替換，如圖3所示。比如基因替換操作：在基因組上目的片段兩端分別插入兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)；同樣地，外源片段含有相應(yīng)重組酶識(shí)別位點(diǎn)；通過(guò)重組酶的過(guò)量表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)特異識(shí)別位點(diǎn)之間基因組DNA的替換操作。而將3個(gè)不同的識(shí)別位點(diǎn)組合使用，則可以在基因組上反復(fù)插入大片段DNA[28]。這種重組酶介導(dǎo)的大片段編輯效率高、專一性好，而且宿主通用性強(qiáng)。但是仍存在一個(gè)瓶頸問(wèn)題，即重組酶的特異性識(shí)別序列難以自定義改造，所以必須在基因組中預(yù)先引入重組酶的識(shí)別位點(diǎn)，這往往需要借助其他方法。最新研究的一種策略是將位點(diǎn)專一重組和二型內(nèi)含子歸巢相結(jié)合[29]，這種方法能有效地解決這個(gè)瓶頸問(wèn)題，顯著提高基因組上大片段改造的效率。

3.2 二型內(nèi)含子歸巢介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)

二型內(nèi)含子歸巢是近幾年發(fā)展的一種高效基因組插入技術(shù)，具有較好的通用性，已被廣泛地應(yīng)用于各種宿主細(xì)胞，包括一些遺傳操作比較困難的細(xì)菌，如梭菌[30]。該技術(shù)也已被Sigma公司商業(yè)化，用于自定義高效編輯不同細(xì)菌的基因組。被研究最多的是來(lái)源于乳酸乳球菌的Ll.LtrB內(nèi)含子，此外最近還開(kāi)發(fā)一個(gè)新的來(lái)源于的EcI5內(nèi)含子[31]。這些內(nèi)含子的歸巢原理如圖3所示：當(dāng)內(nèi)含子經(jīng)過(guò)外源質(zhì)粒的引入，并轉(zhuǎn)錄成為RNA時(shí)，折疊成為具有特殊三級(jí)結(jié)構(gòu)的功能RNA；在自身編碼的一個(gè)多功能輔助蛋白的幫助下，內(nèi)含子上兩個(gè)特異性識(shí)別位點(diǎn) (EBS1和EBS2) 被相互靠近，用于互補(bǔ)識(shí)別基因組上的相互靠近的兩個(gè)特異位點(diǎn) (E1和E2)；三級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子RNA核酶切割并連接DNA鏈，由輔助蛋白將其逆轉(zhuǎn)錄為編碼的DNA；在胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)幫助下，完成內(nèi)含子DNA的插入歸巢。二型內(nèi)含子的插入特異性由EBS1和EBS2決定，而這兩個(gè)位點(diǎn)的序列可根據(jù)一定的算法進(jìn)行修改，從而特異性識(shí)別基因組上不同的位點(diǎn)，幾乎可實(shí)現(xiàn)基因組的隨機(jī)編輯[32]。在一些微生物中，這種內(nèi)含子介導(dǎo)的基因組插入效率可高達(dá)80%，且無(wú)需抗性篩選標(biāo)記[33]。

圖3 基因組上大片段DNA的高效編輯技術(shù)[29]

3.3 基因組大片段DNA高效編輯技術(shù)

將二型內(nèi)含子介導(dǎo)的高效定點(diǎn)插入技術(shù)與位點(diǎn)專一性重組介導(dǎo)的大片段DNA編輯技術(shù)相結(jié)合，被稱為GETR (Genome editing via targetrons and recombinases) 技術(shù)[29]。GETR能夠在基因組上多重位點(diǎn)進(jìn)行大片段DNA的插入、刪除、翻轉(zhuǎn)以及剪切-粘貼等操作，包括在中插入12 kb的聚酮合成操縱子或剪切-粘貼120 kb的基因組、在金黃色葡萄球菌中多個(gè)區(qū)域同時(shí)刪除120 kb的基因組、在枯草芽胞桿菌中翻轉(zhuǎn) 1.2 Mb的基因組等。而且這種大片段基因組修飾過(guò)程無(wú)需選擇性標(biāo)記，其效率接近100%。其基本原理如圖3所示：將二型內(nèi)含子Ll.LtrB或EcI5進(jìn)行改造，使改造的內(nèi)含子包含有重組酶Cre的特異性識(shí)別位點(diǎn)位點(diǎn)，并恢復(fù)內(nèi)含子的歸巢效率；通過(guò)改造的內(nèi)含子，能夠?qū)⒉煌稽c(diǎn)高效地插入到基因組的多個(gè)目標(biāo)位置；通過(guò)Cre的重組作用，實(shí)現(xiàn)基因組上大片段的高效編輯。

4 基因組自主編輯的新策略

局限于對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的有限認(rèn)識(shí)，并非所有的細(xì)胞特性都能通過(guò)理性的技術(shù)進(jìn)行改造，比如細(xì)胞的耐受性[34]。而生物系統(tǒng)是一個(gè)自主裝系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化和選擇，形成了一個(gè)魯棒的生物細(xì)胞，使細(xì)胞各個(gè)元件能夠協(xié)同作用，適應(yīng)脅迫環(huán)境并獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，所以微生物基因組系統(tǒng)內(nèi)存在的進(jìn)化能力，可進(jìn)行自主編輯，提升自身系統(tǒng)[35-36]。應(yīng)用基因組進(jìn)化，近幾年也開(kāi)發(fā)了一些新的基因組進(jìn)化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因組自主編輯，如圖4所示，比如結(jié)合原生質(zhì)體融合的基因組重排技術(shù) (Genome shuffling)[37]、改造基因組范圍轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序的全局轉(zhuǎn)錄因子工程 (Global transcription machinery engineering, gTME)[38]、基因組復(fù)制機(jī)器工程輔助的連續(xù)進(jìn)化(Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)[39]以及環(huán)境條件誘導(dǎo)的適應(yīng)性進(jìn)化策略 (Stress-induced-mutagenesis (SIM) based adaptive evolution)[40]等。

圖4 新發(fā)展的微生物基因組進(jìn)化技術(shù)

這些基因組自主編輯技術(shù)具有不同的特點(diǎn)，并能夠有效改造微生物細(xì)胞的復(fù)雜表型：

1) 基因組重排技術(shù) (圖4A)，是將傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù) (獲得豐富多樣性表型的出發(fā)突變株文庫(kù))、原生質(zhì)體融合技術(shù) (不同突變株間基因組發(fā)生重排) 與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，使誘變過(guò)程中產(chǎn)生的豐富的基因組 (多種突變表型)，由原生質(zhì)體融合而發(fā)生大片段重排。隨后，經(jīng)過(guò)選擇，使多種正向突變?cè)谌诤暇曛蟹e累，加速獲得目的性狀的突變菌株，消除傳統(tǒng)誘變步步積累的繁瑣、低效以及積累大量有害突變的缺點(diǎn)。該技術(shù)的首次應(yīng)用是提高乳酸生產(chǎn)菌的低pH耐受性[37]。首先是通過(guò)兩種方法獲得的表型多樣性的起始親本突變菌株，包括恒化培養(yǎng) (馴化) 和NTG誘變；再者，經(jīng)過(guò)5輪遞歸原生質(zhì)體融合，最終篩選到了5株低pH耐受性顯著提高的乳酸生產(chǎn)菌。通過(guò)兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的標(biāo)記證實(shí)了耐受性提高的菌株發(fā)生了基因組重排。

2) 全局轉(zhuǎn)錄因子工程 (圖4B)，是結(jié)合定向進(jìn)化的方法，突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子，使細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序在基因組水平上發(fā)生隨機(jī)變化。也就是定向進(jìn)化 (如易錯(cuò)PCR方法) 核心轉(zhuǎn)錄因子，隨機(jī)改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)器的轉(zhuǎn)錄偏好性和轉(zhuǎn)錄能力，形成差異豐富多樣的轉(zhuǎn)錄程序，篩選最優(yōu)的轉(zhuǎn)錄程序，達(dá)到全細(xì)胞范圍的轉(zhuǎn)錄程序優(yōu)化的目的。如釀酒酵母中[38]，通過(guò)對(duì)RNA聚合酶中的TATA框結(jié)合蛋白 (SPT) 或TATA框結(jié)合輔助蛋白 (TAF) 進(jìn)行多輪的定向進(jìn)化和篩選后，優(yōu)化了釀酒酵母抵抗高濃度乙醇的全細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄程序。如突變體SPT15，顯著提高了酵母在高濃度葡萄糖下的生長(zhǎng)速率和對(duì)高濃度乙醇的耐受能力，使菌株的乙醇生產(chǎn)速率提高70%。基因功能分析表明，突變的全局轉(zhuǎn)錄因子SPT15，使細(xì)胞中上百個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，正是這些基因的組合效果賦予了細(xì)胞新的表型，而非單個(gè)或多個(gè)組合的基因變化。

3) 基因組復(fù)制機(jī)器工程輔助的連續(xù)進(jìn)化 (圖4C)，是最新開(kāi)發(fā)的一種條件性改變基因組復(fù)制機(jī)器的保真性，增加基因組突變率，從而能夠更有效地突變并篩選目的表型的菌株。即通過(guò)多輪的易錯(cuò)PCR，隨機(jī)改造DNA聚合酶中的校正亞基，并將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，改變DNA聚合酶復(fù)制基因組時(shí)的保真性，通過(guò)篩選和富集，獲得突變菌株。例如在改造的進(jìn)化能力時(shí)[39]，對(duì)DNA聚合酶的亞基進(jìn)行易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化，并轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使其在脅迫環(huán)境中進(jìn)行多輪的連續(xù)進(jìn)化并篩選，最終獲得耐受性顯著提高的突變菌株，包括抗生素的抗性、高濃度乙酸或丁醇的耐受性。該方法操作簡(jiǎn)單方便、通用性強(qiáng)，只需引入一個(gè)DNA聚合酶中的校正功能的突變亞基；而且易于擴(kuò)展，GREACE可用于提高工業(yè)菌株對(duì)高濃度底物和高濃度產(chǎn)物耐受性等復(fù)雜表型。

4) 結(jié)合環(huán)境條件誘導(dǎo)作用的適應(yīng)性進(jìn)化策略 (圖4D)。其顯著特點(diǎn)是采用生長(zhǎng)緩慢或者不生長(zhǎng)的細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞自身受環(huán)境脅迫而大幅提升的內(nèi)在進(jìn)化動(dòng)力[41]，加速細(xì)胞的適應(yīng)性進(jìn)化；同時(shí)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞突變與篩選的同步，不但減少篩選的過(guò)程，也簡(jiǎn)化操作時(shí)間，能夠快速地獲得突變菌株[40]。應(yīng)用該方法，經(jīng)過(guò)12輪的突變篩選，能夠?qū)⒌亩〈甲钚∫种茲舛葟淖畛醯?.5 g/L提高到13 g/L；而通過(guò)5輪的突變篩選，的高滲透壓耐受性和溫度耐受性也被顯著提升。所以，應(yīng)用基因組內(nèi)在的誘導(dǎo)性進(jìn)化動(dòng)力，結(jié)合環(huán)境脅迫因素，能夠提升基因組自主編輯的效率，用于改造一些復(fù)雜的生理表型。

5 結(jié)論

結(jié)合高通量的DNA合成技術(shù)和高效的遺傳操作新工具，基因組編輯技術(shù)不斷推陳出新，能更有效地解決工業(yè)微生物改造中的許多瓶頸問(wèn)題，包括基因組上多重位點(diǎn)的同步組合優(yōu)化、無(wú)需抗生素輔助篩選的高效基因組修飾、大片段基因組的改造和復(fù)雜表型的改造等。新的基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用，極大提升了工業(yè)菌種的改造速度，現(xiàn)已成為應(yīng)用研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。如Genomatica、Codexis、LS9、Genencor等為代表的一批公司已在這方面積累核心技術(shù)。Genomatica利用自身發(fā)展起來(lái)的基因組工程技術(shù)和基因組網(wǎng)絡(luò)改造策略，對(duì)1,4-丁二醇、丙烯酸、異丙醇等化工產(chǎn)品的生物制造路線申請(qǐng)了超過(guò)70份概念型專利。由此可見(jiàn)，工業(yè)微生物基因組編輯技術(shù)將在未來(lái)幾年得到廣泛應(yīng)用。例如，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中的重要微生物進(jìn)行基因組改造，構(gòu)建全新的生產(chǎn)菌株替代傳統(tǒng)菌株，如氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、色素等，提升或淘汰現(xiàn)有生產(chǎn)方式；構(gòu)建新型的合成代謝網(wǎng)絡(luò)和工業(yè)生產(chǎn)菌株以及新型的微生物生態(tài)群落，實(shí)現(xiàn)新型能源和新材料的生物制造等。但這些技術(shù)的快速發(fā)展也面臨一些問(wèn)題。如一些高效的基因組編輯技術(shù)只能在一些容易遺傳操作的模式菌中應(yīng)用，難以應(yīng)用到其他微生物；工業(yè)菌株的改造靶點(diǎn)，需要由較為成熟的計(jì)算機(jī)工具輔助，這些方面仍需要不斷地完善。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Genome editing of industrial microorganism

Linjiang Zhu1,2, and Qi Li1,2

1 The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China2 Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Genome editing is defined as highly-effective and precise modification of cellular genome in a large scale. In recent years, such genome-editing methods have been rapidly developed in the field of industrial strain improvement. The quickly-updating methods thoroughly change the old mode of inefficient genetic modification, which is “one modification, one selection marker, and one target site”. Highly-effective modification mode in genome editing have been developed including simultaneous modification of multiplex genes, highly-effective insertion, replacement, and deletion of target genes in the genome scale, cut-paste of a large DNA fragment. These new tools for microbial genome editing will certainly be applied widely, and increase the efficiency of industrial strain improvement, and promote the revolution of traditional fermentation industry and rapid development of novel industrial biotechnology like production of biofuel and biomaterial. The technological principle of these genome-editing methods and their applications were summarized in this review, which can benefit engineering and construction of industrial microorganism.

genome editing, ssDNA-mediated recombination, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, group-II intron, evolutionary engineering

June 18, 2014;Accepted:September 15, 2014

Qi Li. Tel: +86-510-85918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

Supported by:the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. JUSRP51306A, JUDCF13008, JUSRP51402A), Jiangnan University Basic Research Foundation for Young Scholars (No. 1012050205134030), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, the 111 Project (No. 111-2-06), the Jiangsu Province “Collaborative Innovation Center for Advanced Industrial Fermentation” Industry Development Program.

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資金 (No. JUSRP51306A, JUSRP51402A, JUDCF13008)，江南大學(xué)基本科研-青年基金項(xiàng)目(No. 1012050205134030)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目，111引智計(jì)劃 (No. 111-2-06)，江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

2014-10-14

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140340.html