薄芳芳，許召賢，孫朱貞，曹長(zhǎng)虹，夏軍，徐虹，馮小海

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氧載體對(duì)小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響

薄芳芳1,2，許召賢1,2，孫朱貞1,2，曹長(zhǎng)虹1,2，夏軍1,2，徐虹1,2，馮小海1,2

1 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009 2 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 210009

薄芳芳, 許召賢, 孫朱貞, 等. 氧載體對(duì)小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 431–435.Bo FF, Xu ZX, Sun ZZ, et al. Effect of oxygen-vectors on the production of ε-poly-L-lysine. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 431–435.

為了有效改善發(fā)酵體系中的溶氧水平，提高小白鏈霉菌PD-1發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的能力，文中通過對(duì)氧載體的種類、最佳添加濃度以及添加時(shí)間進(jìn)行篩選，最終確定在0 h添加0.5% (/) 的正十二烷促進(jìn)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)效果最佳。在5 L發(fā)酵罐0 h添加0.5%的正十二烷進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量和菌體干重分別可以達(dá)到(30.8±0.46) g/L和(33.8±0.29) g/L，較之對(duì)照組分別提高了31.6%和20.7%。ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量和菌體干重的提高歸因于0.5%正十二烷的添加促進(jìn)發(fā)酵液中溶氧水平從23.8%提高到32%，同時(shí)發(fā)酵液中的一種主要副產(chǎn)物(聚二氨基丙酸) 的含量下降31%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正十二烷的添加可以提高PD-1發(fā)酵液中的溶氧水平，抑制副產(chǎn)物的生成，促進(jìn)ε-聚賴氨酸的合成。

正十二烷，氧載體，ε-聚賴氨酸，小白鏈霉菌PD-1

ε-聚賴氨酸 (ε-poly-L-lysine，簡(jiǎn)稱ε-PL) 是由人體必需氨基酸L-賴氨酸的ε-氨基與α-羧基通過酰胺鍵連接而成的L-賴氨酸同聚物[1-2]。ε-PL有廣譜的抑菌性，是一種高效安全的食品防腐劑。此外，ε-PL在化妝品、吸水樹脂、藥物緩釋材料等方面也有廣泛應(yīng)用。ε-PL作為生物防腐劑已獲得美國(guó)食品與藥品管理局 (FDA) 批準(zhǔn)，并進(jìn)入日本、歐洲和韓國(guó)等市場(chǎng)[3-4]。中國(guó)衛(wèi)計(jì)委2014年第5號(hào)文 (2014年4月29日) 也將ε-PL批準(zhǔn)用于食品添加劑。ε-PL主要通過微生物發(fā)酵方法得到，本課題組在前期工作中篩選得到一株高產(chǎn)ε-PL的白色鏈霉菌菌株，命名為PD-1，并且在其發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)另一種聚氨基酸聚二氨基丙酸(PDAP)[5]。我們發(fā)現(xiàn)在PD-1發(fā)酵過程中溶氧是影響ε-PL生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。ε-PL合成時(shí)期發(fā)酵液粘稠，溶氧水平較低，菌體生長(zhǎng)和ε-PL產(chǎn)量受到明顯的影響。

傳統(tǒng)提高發(fā)酵液中溶氧水平的方法有提高攪拌轉(zhuǎn)速和增大通氣量等，但這會(huì)造成剪切應(yīng)力過大、泡沫增多、不易控制等現(xiàn)象的發(fā)生。增大攪拌轉(zhuǎn)速和提高通氣量也會(huì)增加運(yùn)行費(fèi)用和設(shè)備成本[6]。目前許多其他有效的方法被用來改善發(fā)酵中菌體對(duì)氧氣需求的問題，如將攜帶氧的基因血紅蛋白基因克隆到目的菌株中[7]；向發(fā)酵液中加入分子氧底物[8]；菌株和藻類共培養(yǎng)[9]。利用氧載體提高發(fā)酵過程中的氧傳遞效率也是一種目前應(yīng)用較廣泛的方法。朱艷等[10]在發(fā)酵液中添加氧載體提高了番茄紅素的產(chǎn)量；顏日明等[11]添加正十二烷進(jìn)行雙液相發(fā)酵，其發(fā)酵生物量和油脂產(chǎn)量分別提高了25.3%和41.8%；張丹等[12]通過添加氧載體也提高了另外一種聚氨基酸γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。為了探討不同種類的氧載體對(duì)PD-1生產(chǎn)ε-PL的影響，本實(shí)驗(yàn)中選取了常見的幾種氧載體進(jìn)行研究，以期望為實(shí)現(xiàn)ε-PL產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

小白鏈霉菌PD-1，本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[13]。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵

方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

采用5 L攪拌式發(fā)酵罐 (KoBio Tech Co. Ltd., Korea)。初始裝液量2.7 L，接種量10%。采用兩階段pH控制工藝進(jìn)行ε-PL批次補(bǔ)料發(fā)酵：第一階段即菌體生長(zhǎng)階段，控制較高pH值(約6.0)；第二階段即產(chǎn)物合成階段，控制較低pH值 (4.0)。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖含量低于10 g/L時(shí)，通過流加補(bǔ)料的方式維持葡萄糖含量為10 g/L。

1.2.3 ε-PL與PDAP的含量檢測(cè)

方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 菌體干重測(cè)定和發(fā)酵液中葡萄糖含量測(cè)定

方法參照文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶氧水平對(duì)發(fā)酵體系的影響

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行批次不補(bǔ)料發(fā)酵，維持其他條件不變，通過改變通氣量來調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的溶氧水平，對(duì)PD-1發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL進(jìn)行研究。結(jié)果表明ε-PL的產(chǎn)量隨著溶氧水平的提高而增加，在30%的溶氧水平下達(dá)到最高產(chǎn)量4.3 g/L。同時(shí)，PD-1發(fā)酵液中一種主要副產(chǎn)物PDAP的產(chǎn)量在較高溶氧水平時(shí)減少。

在發(fā)酵初始階段添加各種不同濃度的氧載體，研究其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。以不添加氧載體為對(duì)照，在裝液量100 mL/1 000 mL的三角瓶中培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定發(fā)酵參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同氧載體最適添加量對(duì)ε-PL生產(chǎn)的影響

由表1可知，不同種類的氧載體對(duì)ε-PL的產(chǎn)量和PD-1菌體干重均有顯著影響，其中添加正十二烷效果最為顯著。在搖瓶發(fā)酵中添加0.5% (/) 正十二烷，ε-PL產(chǎn)量可以提高45%。并且PD-1在以正十二烷作為唯一碳源的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，說明菌體并不能利用正十二烷。最終從對(duì)ε-PL的促進(jìn)效果以及經(jīng)濟(jì)性考慮，本實(shí)驗(yàn)選取正十二烷為最適氧載體，0.5% (/) 為最適添加比例。

2.3 正十二烷添加時(shí)間對(duì)ε-PL生產(chǎn)的影響

在搖瓶發(fā)酵的0、12、24、36、48 h時(shí)分別添加0.5% (/) 的正十二烷，根據(jù)測(cè)定ε-PL的產(chǎn)量，確定氧載體的最佳添加時(shí)間。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在0 h添加氧載體，ε-PL產(chǎn)量提高最多，同時(shí)副產(chǎn)物PDAP可以較大程度被抑制。

2.4 5 L發(fā)酵罐中添加氧載體對(duì)ε-PL生產(chǎn)的影響

我們?cè)? L發(fā)酵罐中添加0.5% (/) 的正十二烷進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵，并對(duì)ε-PL和PDAP產(chǎn)量、菌體干重和溶氧水平等參數(shù)進(jìn)行考察。由圖1可知，添加0.5% (/) 的正十二烷以后，在ε-PL合成階段發(fā)酵液中的溶氧水平從23.8%提高到32%，說明添加正十二烷對(duì)發(fā)酵液中溶氧不足的現(xiàn)象有很大的緩解作用。添加正十二烷后ε-PL產(chǎn)量達(dá)到30.8 g/L，和對(duì)照相比提高了31.6%；菌體干重最終達(dá)到33.8 g/L，和對(duì)照相比提高了20.7%，說明適量氧載體的添加對(duì)菌體干重和ε-PL的合成有很大的提高作用。Yamanaka等[14-15]在對(duì)聚賴氨酸合成酶 (Pls) 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與動(dòng)力學(xué)研究中指出胞內(nèi)ATP水平是ε-PL合成代謝的關(guān)鍵調(diào)控因素。發(fā)酵液中溶氧水平的提高，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞呼吸作用的增強(qiáng)，導(dǎo)致胞內(nèi)ATP水平的提高，ATP水平的提高，不僅為細(xì)胞生產(chǎn)提供了能量，而且有利于聚賴氨酸合成酶催化L-賴氨酸合成ε-PL。同時(shí)添加0.5% (/) 正十二烷后，PD-1發(fā)酵液中一種副產(chǎn)物PDAP合成受到抑制，PDAP的產(chǎn)量從4.32 g/L降低到2.98 g/L，與對(duì)照相比降低31%。副產(chǎn)物產(chǎn)量降低，底物轉(zhuǎn)化率提高，也是添加正十二烷促進(jìn)ε-PL產(chǎn)量提高的另外一種原因。

2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物比合成速率是表征發(fā)酵過程的重要參數(shù)。根據(jù)比生長(zhǎng)速率的定義，μ=dCx/(Cxdt)，我們應(yīng)用Origin 8.0軟件，通過曲線擬合的方法來近似計(jì)算PD-1培養(yǎng)過程中的比生長(zhǎng)速率和ε-PL比合成速率。

去年6月，八十九團(tuán)遭受罕見冰雹襲擊，全團(tuán)七萬余畝棉花絕收，好多植棉職工外出打工，陳建輝的采棉機(jī)和抓花機(jī)也只能到地方上找活干，他又開始思索，為何就抱著一產(chǎn)不撒手呢。

分析結(jié)果表明，兩種情況下細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和ε-PL比合成速率的變化趨勢(shì)相同 (圖2)，但是添加正十二烷后，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，PD-1菌體比生長(zhǎng)速率及ε-PL比合成速率均較對(duì)照組大。兩組菌體均在16 h到達(dá)最大細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 (圖2A)，對(duì)照組為0.015 h–1，添加十二烷后，達(dá)到0.18 h–1，在90 h后兩種情況下均趨于平衡，此時(shí)菌體生長(zhǎng)基本出現(xiàn)停滯。從ε-PL比合成速率 (圖2B) 可以看出，對(duì)照組菌體在100 h達(dá)到最大ε-PL比合成速率0.013 h–1；添加正十二烷后，菌體在110 h達(dá)到最大ε-PL比合成速率0.018 h–1，并且在80 h后ε-PL比合成速率就已經(jīng)大于對(duì)照組。同時(shí)，從圖中可以看出在培養(yǎng)過程時(shí)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物(ε-PL) 的合成要落后于細(xì)胞的生長(zhǎng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)的減慢期或靜止期才有次級(jí)代謝產(chǎn)物的大量積累。正十二烷的加入可以促進(jìn)前期菌體的生長(zhǎng)，對(duì)后期ε-PL的合成也有很明顯的提高作用。

圖2 5 L發(fā)酵罐中添加正十二烷對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

3 結(jié)論

本文將6種氧載體添加到PD-1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，均對(duì)ε-PL的產(chǎn)量起到促進(jìn)作用，其中正十二烷的效果最好。在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵初始時(shí)期加入0.5% (/) 的正十二烷，ε-PL合成時(shí)期發(fā)酵液中溶氧水平從23.8%提高到32%，PD-1的ε-PL產(chǎn)量和生物量分別達(dá)到30.8 g/L和33.8 g/L，和對(duì)照相比分別提高了31.6%和20.7%，同時(shí)適宜的溶氧水平可以抑制主要副產(chǎn)物PDAP的生成。氧載體的加入對(duì)發(fā)酵液中的溶氧水平有很大的提高作用，對(duì)高耗氧發(fā)酵體系的構(gòu)建具有重要意義。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect of oxygen-vectors on the production of ε-poly-L-lysine

Fangfang Bo1,2, Zhaoxian Xu1,2, Zhuzhen Sun1,2, Changhong Cao1,2, Jun Xia1,2, Hong Xu1,2, and Xiaohai Feng1,2

1 S,210009,,2,,210009,,

To enhance the production of ε-poly-L-lysine (ε-PL) by improving dissolved oxygen level of the fermentation system, different oxygen-vectors were added to broth and n-dodecane was screened as the best oxygen-vector. The best amount of n-dodecane was 0.5% (/) and the best time was at start of the fermentation. In a fed-batch fermentation in a 5 L bioreactor, ε-PL concentration reached a maximum of (30.8±0.46) g/L and the dry cell weight obtained was (33.8±0.29) g/L, increasing by 31.6% and 20.7% compared with the control group, respectively. This improvement can be related to 0.5% n-dodecane could maintain dissolved oxygen concentration >32% of air concentration compared with 23.8% in ε-PL production phase, and the production of a main by-product, poly-L-diaminopropionic acid, fell by 31%.These results indicated that the dissolved oxygen level in the broth was improved by adding n-dodecane, which can inhibit the by-product production and improve the biosynthesis of ε-PL.

n-dodecane, oxygen-vectors, ε-poly-L-lysine,PD-1

July 4, 2014; Accepted: October 14, 2014

Xiaohai Feng. Tel: +86-25-58139433; E-mail: fengxiaohai@njtech.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21176123), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733603 ), Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20113221130001), the Foundation of State Key Laboratory of Chemical Engineering Materials.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21176123)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB733603)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (No. 20113221130001)，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助。

2014-12-03

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140354.html