梁秋玲，吳勝

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Baeyer-Villiger單加氧酶非保守Hinge影響酶的催化活性和立體選擇性

梁秋玲1,2，吳勝1

1 中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049

梁秋玲, 吳勝. Baeyer-Villiger單加氧酶非保守Hinge影響酶的催化活性和立體選擇性. 生物工程學報, 2015, 31(3): 361–374.Liang QL, Wu S. Nonconserved hinge in Baeyer-Villiger monooxygenase affects catalytic activity and stereoselectivity. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 361–374.

Baeyer-Villiger單加氧酶是一種重要的生物催化劑，可用于合成一系列有價值的酯和內(nèi)酯化合物。通過序列比對和晶體結(jié)構分析推測連接NADPH結(jié)構域和FAD結(jié)構域的一段非保守Hinge可能在酶對底物識別和催化氧化過程中扮演著重要角色。在以環(huán)己酮單加氧酶為模型的研究中發(fā)現(xiàn)，對該Hinge結(jié)構進行同源序列替換得到的突變體幾乎完全喪失了催化活性，證明了其整體水平的重要性。丙氨酸掃描突變揭示其中一些位點對酶的功能有顯著影響：K153位點的改變使酶的活性下降，立體選擇性卻更優(yōu)化；L143位點的改變對酶的活性影響較小，卻降低了立體選擇性；L144位點的改變則同時大幅度削弱酶的活性和立體選擇性。將同樣的方法運用在苯丙酮單加氧酶中，我們得到了相似的結(jié)論，證明這些位點的重要功能在Baeyer-Villiger單加氧酶家族中有一定的普遍性。這一研究增進了對Baeyer-Villiger單加氧酶的結(jié)構與功能關系的認識，有助于底物結(jié)合口袋的精確描述和Baeyer-Villiger單加氧酶催化圖景的進一步細化，對未來相關的理性設計和定向改造研究提供了借鑒。

Baeyer-Villiger單加氧酶，環(huán)己酮單加氧酶，同源替換，丙氨酸掃描突變

Baeyer-Villiger氧化反應是一類重要的有機化學反應，它能實現(xiàn)功能基的轉(zhuǎn)化，活化C-C鍵進行環(huán)擴張，進而合成一系列有價值的手性酯和內(nèi)酯化合物[1]。這一反應在1899年就被首次報道[2]，人們也一直致力于研究使用各種有效的催化劑來實現(xiàn)這一反應[3]。但是由于化學催化劑本身固有的弱點，催化效率低、選擇性低、污染以及反應過程復雜副產(chǎn)物多等，研究者們開始向生物酶催化領域?qū)ふ腋鼉?yōu)越的催化劑。

早在1976年，第一個Baeyer-Villiger單加氧酶CHMO就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和分離[4]，此后又有許多各種不同類型的BVMO被發(fā)現(xiàn)。本世紀初相繼有類固醇單加氧酶 (Steroid monooxygenase, STMO)[5]、對羥基苯乙酮(4-Hydroxyacetophenone monooxygenase)[6]、環(huán)戊酮單加氧酶(Cyclopentanone monooxygenase, CPMO)[7-8]等新型BVMO的報道。2002年，Ⅰ型BVMO的特異性序列被首次提出[9]，以此為基礎，人們通過基因組挖掘 (Genome mining) 的方法，在細菌和真菌基因組中都發(fā)現(xiàn)大量Ⅰ型BVMO特異性序列的分布，在動物和植物細胞中則不存在Ⅰ型BVMO[10]。近年來，關于BVMO多樣性的報道越來越多[11-12]，有許多BVMO都在微生物代謝途徑中起著重要作用[13-14]。

這些酶的發(fā)現(xiàn)無疑給涉及Baeyer-Villiger單加氧反應的工業(yè)生產(chǎn)和藥物生產(chǎn)帶來了革新的希望[15-16]。事實上，許多研究證明，BVMO還在許多其他領域表現(xiàn)出很好的運用價值，例如，潛在的藥物靶點設計[17]、潛在的基團保護方式等[18]。因為其廣泛的作用，近年來，人們對各類新型BVMO從晶體結(jié)構、催化機制、底物譜和立體選擇性等方面進行了大量的研究，也取得了一系列重要突破。其中具有劃時代意義的是2004年PAMO晶體結(jié)構的首次提出[19]。PAMO晶體結(jié)構由兩個結(jié)構域組成：FAD和NADPH結(jié)構域，其催化活性位點位于晶體表面的一個凹縫處。2009年，又有第2個BVMO的晶體結(jié)構被解析出[20]，揭示了CHMO兩種不同狀態(tài)的晶體結(jié)構?！伴_”、“閉”兩種結(jié)構的展示進一步細化了BVMO的催化圖景，說明BVMO催化反應是一個動態(tài)的過程，輔基會在其催化位點發(fā)生位移。同年還發(fā)現(xiàn)了另一種不依賴于FAD和NADPH的BVMO——MtmOIV的晶體結(jié)構，這一類BVMO被稱為Ⅱ型BVMO[21-22]。2012年，Yachnin等[23]首次報道了CHMO與底物小分子環(huán)己酮相結(jié)合的晶體結(jié)構，向我們清晰地展示了BVMO催化過程中與底物結(jié)合形成的重要中間體的形態(tài)。這些晶體的解析有助于深入理解這一類酶的底物識別及催化機制，并為酶的分子改造提供重要的結(jié)構信息。近些年來，結(jié)合結(jié)構信息和實驗室定向進化的手段建立突變酶庫，并從中篩選出最適用于生產(chǎn)應用的突變株已經(jīng)成為BVMO的研究熱點。其中研究背景最悠久的CHMO和熱穩(wěn)定性最好的PAMO成為研究工作者們青睞的對象。

蛋白晶體的解析、結(jié)構信息的闡釋以及眾多分子定向進化的成功例子都讓我們對BVMO的底物識別、催化機制等有了更深的認識。但是催化過程中的位移細節(jié)乃至催化的精確機制至今未知，包括底物和氧氣分子的激活、中間體如何形成、中間體如何穩(wěn)定等。特別是這些過程如何精細調(diào)控了各種BVMO獨特的底物特異性和立體選擇性還有待進一步深入研究。為了探索這些問題的答案，本研究首先對BVMO的基因序列和晶體結(jié)構進行深入分析，在底物結(jié)合口袋附近發(fā)現(xiàn)了一段連接NADPH結(jié)構域和FAD結(jié)構域在BVMO催化過程中形態(tài)難以固定的區(qū)域，即HingeⅠ結(jié)構。迄今為止，對Hinge的認識多數(shù)還停留在結(jié)構數(shù)據(jù)支撐上，并沒有系統(tǒng)地對酶催化功能影響的研究，少數(shù)研究也只是淺嘗輒止[24-25]。本課題以CHMO為模型，旨在探索非保守Hinge對酶催化行為的影響，通過改進的Quick-change和overlap PCR方法獲得一系列CHMO突變酶，包括兩個HingeⅠ同源序列替換突變體CHMOPAMO、CHMOSTMO以及HingeⅠ序列的丙氨酸掃描突變體。通過對突變體進行酶的活性檢測和立體選擇性的研究，得到了一些影響CHMO活性和選擇性的重要位點，證明了HingeⅠ這一結(jié)構在CHMO中乃至整個BVMO家族的催化過程中都起著重要作用。這一研究有助于BVMO催化圖景的進一步細化，給我們未來對BVMO理性進化設計和定向改造研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶與試劑

PCR所用的Ex酶以及T載體質(zhì)粒擴增系統(tǒng)、KODDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶分別購自TaKaRa公司(TaKaRa Bio Group)、日本Toyobo公司、NEB (New England Biolabs) 公司以及MBI (MBI Fermentas) 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠電泳回收試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；阿拉伯糖購自北京賽百盛基因技術有限公司；蛋白胨、酵母膏、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Top10、BL21(DE3) Gold以及質(zhì)粒pBAD、pET22b均為本實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容1 L，pH調(diào)為7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基時加1.5%瓊脂。TB培養(yǎng)基：蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油4 mL，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60 ℃，再加入100 mL滅菌的170 mmol/L KH2PO4和 0.72 mol/L K2HPO4的溶液 (2.31 g的KH2PO4和12.54 g K2HPO4溶在足量的水中，使終體積為100 mL)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 突變體構建

PAMO/CHMO/STMO的基因序列分別來自NCBI數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 的噬熱裂孢菌(AAZ55526)，不動桿菌sp. NCIMB9871 (BAA86293) 和玫瑰色紅球菌(BAA24454)。

同源序列替換突變體構建：將CHMO的HingeⅠ序列分別替換成PAMO和STMO的HingeⅠ序列，得到突變體CHMOPAMOand CHMOSTMO。具體替換過程見補充材料2 (SM2)。CHMOPAMO和CHMOSTMO被連接到pET22b中，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3) Gold中進行蛋白表達。

丙氨酸掃描突變體構建：使用Quick-change PCR[24]方法構建以下突變體：1) CHMO: Leu143Ala/Leu144Ala/Ser145Ala/Pro147Ala/Asn148Ala/Leu149Ala/Pro150Ala/Leu151Ala/Ile152Ala/Lys153Ala; 2) PAMO: Gln152Ala/Leu153Ala/Ser1 54Ala/Val155Ala/Pro156Ala/Gln157Ala/Leu158Ala/Pro159Ala/Asn160Ala/Phe161Ala/Pro162Ala。

PCR反應體系為25 μL終體積：10×KOD緩沖液 (2.5 μL)，MgCl2(1 μL, 0.025 mol/L)，dNTPs (5 μL，每種核苷酸濃度為0.002 mol/L)，引物 (0.5 μL，正反引物濃度均為2.5 μmol/L)，模板質(zhì)粒 (1 μL，10 ng/μL) 和1單位KOD DNA聚合酶。PAMO的PCR反應循環(huán)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s以及72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min以及72 ℃延伸7 min，循環(huán)35次；最后在72 ℃下延伸30 min。CHMO的PCR條件中，第2次循環(huán)的退火溫度為56 ℃，延伸時間為8 min，其他參數(shù)與PAMO相同。

PCR之后取10 μL PCR產(chǎn)物，加入1.2 μL NEB緩沖液，1 μL DpnⅠ，37 ℃處理3 h。最后轉(zhuǎn)入Top10 或者BL21(DE3) Gold宿主菌。

1.2.2 突變體基因表達

重組質(zhì)粒pET22b-CHMO轉(zhuǎn)入BL21(DE3) Gold，細胞在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。每5 mL過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)入200 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至600到達0.6，此時加入終濃度為25 μmol/L IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 誘導，并將培養(yǎng)溫度調(diào)至20 ℃，轉(zhuǎn)速調(diào)至150 r/min，培養(yǎng)12 h。最后，細胞以0.9% NaCl洗滌收集。重組質(zhì)粒pBAD-PAMO轉(zhuǎn)入Top10中，5 mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入200 mL含有0.1%阿拉伯糖誘導劑和100 μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)20 h。最后細胞同樣以0.9% NaCl洗滌收集。這兩種重組細胞都將用于全細胞生物催化和酶活檢測。

1.2.3 全細胞催化

通過測定600的方法將表達不同突變蛋白的細胞調(diào)成相同濃度，然后將細胞懸浮于10 mL緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0) 中。取其中500 μL，放入終濃度為1 mmol/L底物進行反應，PAMO對絕大部分底物反應溫度設置為35 ℃，芳香環(huán)酮類底物反應溫度設置為37 ℃。CHMO反應溫度均為32 ℃。所有反應均在 13 000 r/min的振蕩器中完成，反應時間控制在12 h (CHMO) 或者2 h (PAMO) (PAMO與芳香環(huán)酮類底物的反應時間為12 h)。反應結(jié)束后，樣品以700 μL乙酸乙酯萃取，有機層經(jīng)無水碳酸鈉干燥后進行氣相色譜分析。

1.2.4 蛋白純化及酶活檢測

將收集的新鮮細胞懸浮于10 mL緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0) 中，進行超聲破碎。CHMO及其突變體因純化非常困難，以細胞破碎液直接進行酶活檢測；PAMO及其突變體蛋白進行親和層析的進一步純化，鎳柱的純化步驟為：10 000 r/min、4 ℃離心30 min；將上清加入已被平衡過的GE公司His標簽蛋白純化預裝柱GE Healthcore Histrap FF Crude column (5 mL)上；以含有500 mmol/L NaCl 和25 mmol/L咪唑的Tris-HCl沖洗雜蛋白；以含有500 mmol/L NaCl和200 mmol/L咪唑的Tris-HCl沖洗得到目的蛋白。鎳柱純化之后，將目的蛋白進行過夜透析，最后在441 nm下測其吸光值，以此數(shù)值作為突變體蛋白的相對濃度。酶活檢測實驗中，底物均以20 mmol/L終濃度溶解于乙腈中，NADPH以2 mmol/L終濃度溶于Tris-HCl緩沖液(pH 8.0) 中。反應體系如下：總體積200 μL，底物和NADPH終濃度分別為1 mmol/L和 100 μmol/L，酶用量各有不同，最后以Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0) 補足200 μL總反應體系。將反應體系置于分光光度儀(Spectrophotometer Beckman Counter DU800) 下測340 nm下的光吸收，從其吸光度隨反應時間的變化測定其反應初速度，進而計算其酶活[25]。PAMO及其突變蛋白的蛋白濃度以在441 nm下的吸光值度量[26]，而CHMO及其突變蛋白濃度以Bradford蛋白測定法測定[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVMO基因序列與晶體結(jié)構分析

為了探索BVMO的構效關系，我們以NCBI以及PDB等數(shù)據(jù)庫中BVMO的相關信息為基礎，對BVMO進行了生物信息學分析和晶體結(jié)構分析，如圖1所示。BVMO晶體結(jié)構主要由FAD結(jié)構域和NADPH結(jié)構域組成，兩者之間存在特殊的Hinge結(jié)構。此結(jié)構包括兩條鏈，且在晶體結(jié)構中恰好與BVMO的底物結(jié)合口袋在空間上相近。Hinge結(jié)構的序列比對結(jié)果中，兩條鏈中的短鏈 (HingeⅡ) 保守性非常高而另外一條長鏈 (HingeⅠ) 保守性非常低。HingeⅠ在CHMO與底物結(jié)合的晶體結(jié)構中是缺失的，表明這一段序列在催化過程中柔性比較大，形態(tài)難以在晶體中固定，推測其在底物識別和催化氧化過程中扮演著重要的角色。本研究以CHMO為研究模型，并選取了如圖2所示的各種酮類 (包括脂肪酮、環(huán)戊酮和環(huán)己酮類脂環(huán)酮等) 作為底物，從底物特異性、催化活性和立體選擇性等多個方面探索突變對BVMO催化行為的影響，試圖揭示非保守HingeⅠ的功能。

圖1 BVMO晶體結(jié)構分析以及Hinge結(jié)構序列比對

圖2 本研究中涉及的主要底物

2.2 HingeⅠ功能檢測——整體水平

為了從整體水平上考察HingeⅠ結(jié)構的功能，采用改進的PCR方法組合其他分子克隆手段得到了兩個同源序列替換的突變體，CHMOPAMO和CHMOSTMO，它們是以CHMO為母體鏈的HingeⅠ位置分別被替換成PAMO和STMO的HingeⅠ的重組CHMO序列。將野生型CHMO與重組型進行全細胞水平的SDS-PAGE蛋白電泳，檢測到三者的表達水平相似 (圖3)，證明HingeⅠ的整段替換并沒有影響其表達水平。將它們分別對各種底物進行全細胞催化，并用氣相色譜檢測產(chǎn)物生成情況 (表1)。

對于CHMOSTMO來說，細胞基本上完全失活，只有底物9有極少量的產(chǎn)物生成。同源替換突變體CHMOPAMO則對簡單脂肪環(huán)酮和底物9有較差的活性。野生型CHMO對這些底物有很高的催化活性。同時，那些野生型催化活性較低的底物則完全不能被CHMOPAMO所轉(zhuǎn)化?？梢钥吹?，Hinge I序列的同源替換極大地損害了CHMO的催化活性，證明完整的Hinge I序列對CHMO的催化功能至關重要。

另外，CHMOPAMO突變體進行活性測試的底物中，不僅包括CHMO的活性底物，還包括PAMO的活性底物。PAMO HingeⅠ替換到CHMO HingeⅠ中，不但剝奪了CHMO本身的活性能力，而且也并沒有賦予它任何類似PAMO的活性能力。說明不管對于CHMO還是PAMO，HingeⅠ結(jié)構同蛋白分子的其他部分都是協(xié)調(diào)合作共同起到相應的底物識別和催化作用的，“拆分嫁接”的后果就是兩者整體性都被破壞，從而使酶失去催化功能。

圖3 同源序列替換突變體表達水平檢測

表1 全細胞催化同源序列替換突變體CHMOPAMO和CHMOSTMO

K: is abbreviated for ketone. +++: represents 50%?100% conversion; ++: 10%?50% conversion; +: 0?10% conversion; －: no conversion. Biotransformation was conducted at 32 ℃, lasted for 12 h.

2.3 Hinge I功能檢測——個體水平

通過定點突變得到了10個CHMO Hinge I序列的丙氨酸掃描突變體，分別是：Leu143Ala、Leu144Ala、Ser145Ala、Pro147Ala、Asn148Ala、Leu149Ala、Pro150Ala、Leu151Ala、Ile152Ala和Lys153Ala。其中146位本身是丙氨酸，故而不在突變之列。

2.3.1 丙氨酸掃描突變體蛋白表達水平檢測

所有的丙氨酸掃描突變體都用SDS-PAGE電泳的方法進行了蛋白表達水平的檢測。與同源系列替換的突變體情況類似，所有的丙氨酸掃描突變體幾乎都和CHMO野生型一樣能大量表達，突變壓力并沒有給蛋白表達造成顯著性影響。后文中我們得到的全細胞催化、氣相檢測和手性拆分中突變酶相對于野生型的改變并沒有蛋白表達量的影響，其性質(zhì)改變的原因源于酶本身的變化。

2.3.2 丙氨酸掃描突變體的活性檢測

同樣是全細胞催化、氣相檢測的手段鑒定各突變體的底物譜，得到表2。大多數(shù)突變體的活性都有部分下降，有些突變體活性改變較少，而有些突變體例如L144A的催化能力被大幅度削弱，特別是它與苯基丙酮的反應，在長達12 h的轉(zhuǎn)化時間下轉(zhuǎn)化率仍然為零。P147A、P150A和L151A則是活性較高的一類突變體，特別是在轉(zhuǎn)化2位取代環(huán)己酮時，表現(xiàn)出比野生型更高的活性。

為了得到更為精確可靠的底物譜，還采用了細胞破碎、酶活測定的方法進一步檢測突變酶的反應活性。由于CHMO純化過程中損耗非常大，純化過程困難，并且我們已經(jīng)證明了野生型CHMO和突變型之間表達水平差異不大，所以以細胞破碎液 (粗酶) 為檢測樣品來比較野生型與突變型之間的酶活差異是合理的。將野生型CHMO和10個突變體的細胞破碎液分別與底物混合，并加入反應必需的輔基NADPH，反應體系放到紫外分光光度儀下檢測25 ℃和 340 nm波長下的光吸收變化，從吸光值對時間的比率中可以得出反應初速率，再通過反應體系中的酶濃度即可得到能反映酶的催化能力的動力學指標——酶的比活。數(shù)據(jù)結(jié)果用圖4的坐標軸方式清晰地展示出來。野生型CHMO在催化大部分底物中仍然是活性最高的一個，除了在催化2位取代環(huán)己酮時P147A和N151A兩種突變體有微弱的優(yōu)勢。L144A在所有縱軸中都是排行最低的，證明其對比于野生型和其他突變體，在所有底物上都表現(xiàn)出最差的催化活性。圖中K153A也是一個活性較差的突變體，盡管它在全細胞催化活性檢測時并沒有突出的表現(xiàn)。其他位于軸線中部的突變體比野生型CHMO催化能力差，但仍維持著中等的活性。

表2 全細胞催化檢測CHMO丙氨酸掃描突變體的活性

K: is abbreviated for “ketone”; RA: relative activity. For a fair comparison, all incubations were for 12 h and relative activities are expressed as the rate of conversion normalized to that obtained with wild-type CHMO. Absolute conversion values for the wild-type CHMO are given in parentheses.

圖4 酶活測定檢測CHMO丙氨酸掃描突變體活性

圖4的實驗結(jié)果與表2基本上一致，除了K153A外，只有L143A在全細胞表達中產(chǎn)率較高而在細胞破碎液酶活測定中活性相對較低。同樣作為檢測催化能力的手段，全細胞催化著眼于整個活細胞的催化功能，不單單由酶本身的性質(zhì)決定，更有酶的表達量以及細胞內(nèi)NADPH濃度等各種其他因素的影響；而酶活檢測則是細胞外相對精確的定量實驗，更能體現(xiàn)酶本身的催化性質(zhì)。

2.3.3 丙氨酸掃描突變體對映選擇性檢測

經(jīng)過萃取得到CHMO及其突變體全細胞催化反應之后體系中的有機相，然后用手性氣相色譜柱進行動力學拆分，得到一系列拆分數(shù)據(jù)，其中與野生型對映選擇性有明顯差異的部分如表3所示。L144A因其催化得到外消旋產(chǎn)物而再次成為表現(xiàn)突出的突變體，而在酶活檢測中和L144A行為相似的K153A卻有較高的化學選擇性，特別是在催化2-丙基環(huán)戊酮時，甚至有比野生型更高的值 (值是度量催化劑立體選擇性的指標，值越大代表選擇性越好[28])。

雙環(huán)[3,2,0]庚-2-烯-6-酮 (Bicyclo [3.2.0] hept-2-en-6-one，底物9) 是研究BVMO化學選擇性的重要模式底物，因同時存在立體選擇性和區(qū)域選擇性，它在被BVMO催化時通常能產(chǎn)生各種構型構象的產(chǎn)物組合，如圖5所示。有報道證明CHMO在催化底物9時有較高的立體選擇性和較差的區(qū)域選擇性[29]，我們的結(jié)論與之一致。大部分CHMO突變體的行為也與野生型相似，反應生成(1S,5R) “正?！毙王ズ?1R,5S) “非正常”型酯。L144A在催化底物9時表現(xiàn)出較低的立體選擇性，并且更傾向于生成“非正?！毙王ィ绫?所示。

表3 CHMO及其突變體的對映選擇性檢測

圖5 BVMO催化底物9的可能結(jié)果

表4 CHMO及其突變體催化底物9的化學選擇性

2.4 PAMO Hinge I的功能檢測

從CHMO的實驗結(jié)果中我們得到了一些顯著影響其功能的重要位點，為了證明這些位點在其他BVMO中是否同樣關鍵，將同樣的研究方法運用于PAMO，得到的結(jié)論與CHMO非常一致。在催化PAMO經(jīng)典底物如苯基丙酮、3-苯基-2-丁酮時，大部分突變體都顯示出中等催化活性，與CHMO中L144A的對應突變體L153A則出現(xiàn)大幅度活性下降，立體選擇性也下降。在催化非經(jīng)典底物如2-丙基環(huán)戊酮、Bicyclo [3.2.0] hept-2-en-6-one (底物9) 時，大部分突變體催化活性呈現(xiàn)出和野生型一樣的低催化活性，而L153A則活性相對較高。另外PAMO中還有非常值得注意的一個位點是Q152，其丙氨酸掃描突變體的活性和立體選擇與L153A一樣大幅度下降，對PAMO的影響程度不亞于K153。此外，CHMO中的對應位點突變體L143A在活性和選擇性上也對CHMO有較大負面影響。我們還用SDS-PAGE檢測了突變體的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達與野生型PAMO基本一致。

以上發(fā)現(xiàn)都說明Hinge I的重要位點在BVMO中很有可能具有普遍的影響力，為研究新型BVMO提供了寶貴的借鑒，同時給BVMO的定向改造和進化提供了新的突破口。

3 討論

本研究以BVMO序列比對和晶體結(jié)構分析為基礎，主要通過同源序列替換以及丙氨酸掃描突變的過程，得到了一系列BVMO突變酶；然后以改進的分子克隆技術、色譜技術以及酶學性質(zhì)研究技術等為手段獲得大量關于BVMO突變酶的底物選擇性、反應活性以及對映選擇性的實驗數(shù)據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)這些突變體在催化活性和化學選擇性上相對于野生型來說有諸多改變，這些實驗證據(jù)使我們能從中獲取更多關于BVMO重要的構效信息。

從整體水平上，Hinge I的多氨基酸替換突變直接導致了CHMO催化功能的幾乎完全喪失。事實上，在通過多個基因同時突變的手段來研究BVMO酶功能的變化時，Dudek等[31]就提到過“累積假說”的概念，即多個位點同時突變對酶功能的影響是由每個位點突變所產(chǎn)生的效應累積而成的。同源序列替換導致的活性完全喪失，表明了在此11個位點中，必然有能嚴重影響CHMO活性的位點存在，這也從側(cè)面說明了本課題最開始的設想——HingeⅠ結(jié)構的重要性是符合事實的。當然，長達11個氨基酸的替換使酶活喪失，還有一個可能是其蛋白結(jié)構發(fā)生了重大改變從而無法進行任何催化造成的，但是我們替換進去的Hinge I序列是BVMO同源序列，同樣能起到支持蛋白結(jié)構的作用。故而其酶活喪失最有可能的原因就是其中的某些非保守氨基酸殘基在催化作用中起著關鍵性的作用。

從個體水平上，Hinge I丙氨酸掃描突變體表現(xiàn)各異，大多數(shù)維持著部分活性，少數(shù)活性與野生型相似，極少數(shù)活性得到了加強，比如PAMO L153A催化2-丙基環(huán)戊酮以及CHMO P147A催化2位取代環(huán)己酮，這或許可以成為我們拓展或者改變BVMO底物譜、定向改造BVMO的一個新的突破口。還有一類就是幾乎完全喪失活性的突變，例如CHMO L144A。CHMO L144A是所有突變體中活性最低的一個，也是所有突變體中立體選擇性最差的一個。我們知道“克利己” (Criegee) 中間體是BVMO催化過程中的一個關鍵形態(tài)，酶結(jié)構域的相對運動與酶和底物識別、結(jié)合密切相關，也即“Criegee”中間體的形成密切相關。CHMO與底物結(jié)合的晶體結(jié)構模型中，也可以看作是“Criegee”中間體模型中，Hinge I是一段在催化過程中有著非常頻繁結(jié)構變動的區(qū)域。這段區(qū)域影響著整個酶的形態(tài)變化以及催化行為。作為這段區(qū)域的第一個氨基酸殘基位點，L144或許在整條鏈的擺動運動中有著重要地位，直接影響著整個BVMO的催化過程。丙氨酸和CHMO此位置上原始的亮氨酸結(jié)構上差異并不大，只有一個單位的CH2的差異，但是卻能使酶產(chǎn)生如此大的變化——酶活大大下降，選擇性幾乎完全喪失。可見這一位點在CHMO中的關鍵作用。CHMO L144位點有著很高的研究價值和改造潛能。

對比其他的BVMO，CHMO L144位點上的亮氨酸非常保守。我們將其對應位點PAMO的L153位點突變成丙氨酸后，也發(fā)現(xiàn)有催化能力的劇烈下降。研究發(fā)現(xiàn)此位點同Q152位點一樣，處于底物結(jié)合區(qū)域的5 ?范圍之內(nèi)[31]，它的突變將有很大可能性對PAMO產(chǎn)生影響。CHMO L144位點和PAMO L153位點的相似性表明，這一位點的重要性在所有的BVMO中很可能具有普遍性。

在CHMO突變體的催化選擇性檢測中，我們發(fā)現(xiàn)K153A突變體的活性有所降低，但是在立體選擇性上卻比野生型CHMO更加優(yōu)秀，這是一個令人驚喜的正向進化。值得注意的是，在大多數(shù)BVMO的此位點上，都是脯氨酸 (Proline)，包括PAMO在內(nèi)?？梢奀HMO這個位點的賴氨酸對其立體選擇性有著十分重要的影響。賴氨酸的側(cè)鏈長度比脯氨酸長很多，這個位點很可能是通過側(cè)鏈的構造影響底物結(jié)合口袋的形態(tài)，進而影響產(chǎn)物構型形成的。

綜上所述，作為連接兩個結(jié)構域的在催化過程中有著明顯擺動的Hinge I結(jié)構對BVMO的催化功能有著關鍵作用，其中最開始的兩個氨基酸以及最后一個氨基酸影響作用最為明顯，是構成整條鏈的重要性的主要原因。對BVMO家族中非保守Hinge I結(jié)構的研究結(jié)果有助于精確描述BVMO底物結(jié)合口袋，進一步細化催化圖景并對未來BVMO理性進化和定向改造研究奠定基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Nonconserved hinge in Baeyer-Villiger monooxygenase affects catalytic activity and stereoselectivity

Qiuling Liang1,2, and Sheng Wu1

1,,,100101,2,100049,

Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) are important biocatalysts to synthesize a series of valuable esters and lactones. Based on protein sequence alignment and crystal structure analysis, a nonconserved hinge which linked NADPH domain and FAD domain was speculated to play an important role in substrate recognition and catalytic oxidation process. Cyclohexanone monooxygenase (CHMO) was selected as a model. Mutants obtained by homologous replacement of the whole hinge almost completely lost its original catalytic activity, demonstrating that the overall hinge structure was of great importance. Some significant sites were identified to greatly affect the catalytic activity and stereoselectivity by alanine scanning mutagenesis, accompanied by enzyme activity assessments and chiral kinetic resolutions. Altering K153 decreased the activity of the enzyme but enhanced the stereoselectivity. Changing L143 site reduced stereoselectivity but had little effect on enzyme activity. Mutation at L144 site dramatically weakened both activity and stereoselectivity. Subsequently, these corresponding sites in phenylacetone monooxygenase were also illustrated to follow a similar rule, revealing a universal importance of these sites in the BVMO family. These results expanded our understanding of the structure-activity relationship of these enzymes and provided more proofs for future directed evolution of BVMOs.

Baeyer-Villiger monooxygenase, cyclohexanone monooxygenase, function, homologous replacement, alanine scanning mutagenesis

May 27, 2014; Accepted: June 4, 2014

Sheng Wu. Tel: +86-10-62628482; Fax: +86-10-64807429; E-mail: shengwu@im.ac.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31070718), Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-EW-J-6).

國家自然科學基金 (No. 31070718)，中國科學院微生物所基礎前沿研究項目 (No. KSCX2-EW-J-6) 資助。