嚴(yán) 賓，鄒寶華

（精華制藥集團股份有限公司，江蘇南通226005）

黑曲霉對20（S）-原人參三醇的微生物轉(zhuǎn)化及條件優(yōu)化

嚴(yán) 賓，鄒寶華

（精華制藥集團股份有限公司，江蘇南通226005）

目的利用微生物轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建制備20（S）-原人參三醇衍生物的新合成途徑，并對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率。方法選取黑曲霉（Aspergillus niger AS 3.1858）為轉(zhuǎn)化菌株，從接菌量、底物濃度、轉(zhuǎn)化時間、加樣時間、溫度、轉(zhuǎn)速等方面對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化。結(jié)果獲得2個20（S）-原人參三醇衍生物，即24-亞甲基-20（S）-原人參三醇和23，24-烯-25-甲氧基-20（S）-原人參三醇；并獲得了優(yōu)化的轉(zhuǎn)化工藝，即接種量為15%、底物濃度為0.25 mmol/L、加樣時間為轉(zhuǎn)種后36 h、培養(yǎng)溫度為26℃、轉(zhuǎn)化時間為5 d、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。結(jié)論該轉(zhuǎn)化方法能簡便地獲得20（S）-原人參三醇衍生物，采用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件，24-亞甲基-20（S）-原人參三醇和23，24-烯-25-甲氧基-20（S）-原人參三醇的產(chǎn)率均明顯增大。

人參三醇/類似物和衍生物； 曲霉菌，黑； 發(fā)酵； 培養(yǎng)基； 生物轉(zhuǎn)化

20（S）-原人參三醇[20（S）-PPT]是人參、三七、西洋參、絞股藍等藥用植物中皂苷類物質(zhì)（包括Rg1、Rg2、Rh1、Re）的主要苷元[1-3]。藥理研究表明，20（S）-PPT能降低人類白血病細胞THP-1、人小腸上皮細胞Int-407和人克隆結(jié)腸腺癌細胞Caco-2的擴散，抑制小鼠黑色素瘤B16-BL6的生長，使其成為人參皂苷中具有最強抗癌活性的皂苷類成分之一[4-7]。與相應(yīng)的皂苷相比，20（S）-PPT相對分子質(zhì)量和極性均小，便于吸收入血而發(fā)揮藥理作用[8]。因此，20（S）-PPT是很有前景的癌癥預(yù)防和治療藥物。

近年來，人們對PPT的結(jié)構(gòu)改造進行了廣泛的研究，主要是對其醇羥基的酯化和氧化還原等，得到烷基衍生物、脂肪酸酯及其堿金屬鹽、氨基酸衍生物等[9-13]。而PPT亞甲基化衍生物和甲氧基化衍生物的制備研究報道較少。本研究從接菌量、底物濃度、加樣時間、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及搖床轉(zhuǎn)速等方面對20（S）-PPT進行了生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，獲得了2個 20（S）-PPT衍生物，為20（S）-PPT的結(jié)構(gòu)修飾開辟了一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 20（S）-PPT購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號：111749-201312），實驗用菌種黑曲霉（Aspergillus nigerAS 3.1858）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，色譜純乙腈購自Merck公司，其他分析純化學(xué)試劑均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Bruker AVANCE 400型核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司）、SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）、ZHWY-2102振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、CH-2顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制作

1.2.1.1 種子培養(yǎng)基的制作 取新鮮土豆200 g，去皮，切成小塊，加入1 000 mL水煮沸，保持沸騰約30 min，用紗布過濾，加水定容至1 000 mL，定容前加入20 g葡萄糖，在250 mL的錐形瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的制作 取新鮮土豆，去皮，切成小塊，加入5倍量水煮沸，保持沸騰狀態(tài)約30 min，用紗布過濾，加水定容，每200克土豆制備1 L培養(yǎng)液，定容前加入20 g葡萄糖，在1 000 mL錐形瓶中裝入400 mL培養(yǎng)液。

1.2.2 微生物轉(zhuǎn)化方法 將菌種放于固體斜面培養(yǎng)基上置4℃冰箱保存?？疾觳煌臃N量（2%、5%、7%、10%、15%、20%）、不同底物濃度（0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）、不同轉(zhuǎn)化時間（1、2、3、4、5、6 d）、不同培養(yǎng)溫度（24、26、30、32℃）、不同加樣時間（12、24、36、48 h）、不同搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、200、220 r/min）對生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)率（產(chǎn)率為單個化合物的測量數(shù)據(jù)除以總的投料量）的影響，并根據(jù)上述各實驗確定的最優(yōu)條件，即以15%的接種量接種入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，36 h后加0.25 mmol/L底物濃度，于26℃、150 r/min轉(zhuǎn)化5 d進行優(yōu)化工藝的驗證試驗，并重復(fù)3次。

1.2.2.1 分析型生物轉(zhuǎn)化方法 在超凈工作臺上用接種針將黑曲霉菌絲從斜面培養(yǎng)基接種于內(nèi)裝100mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。于搖床上160r/min、26℃下培養(yǎng)2 d后，加入0.2 mL 20（S）-PPT（10 mg/mL 95%乙醇溶液），繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收獲。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，合并乙酸乙酯萃取液濃縮至干，殘渣用甲醇溶解，待檢；菌絲體用適量甲醇超聲提取30 min，濾去菌絲體的甲醇液濃縮至干，用甲醇溶解，過0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液用高效液相色譜法（HPLC）進行分析。同時設(shè)計空白對照：空白對照Ⅰ為培養(yǎng)菌液中不加入底物，加入0.2 mL 95%乙醇；空白對照Ⅱ為未接入微生物的培養(yǎng)基中加入底物，觀察培養(yǎng)基對底物的影響。2種空白對照與實驗組平行培養(yǎng)，同法處理。

1.2.2.2 制備型生物轉(zhuǎn)化方法 從試管斜面將微生物接入1個250 mL三角瓶（裝有100 mL土豆培養(yǎng)基）中，于搖床上160 r/min、26℃下培養(yǎng)2 d，用無菌移液管分別移取1 mL菌液至20個1 000 mL三角瓶（裝有400mL土豆培養(yǎng)基）中，振蕩培養(yǎng)2 d后，加入0.5 mL的20（S）-PPT（50 g/L）無水乙醇溶液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，收集發(fā)酵液（8 L），累積投料500 mg。對發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取部分進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷無水乙醇梯度洗脫，獲得不同流分，再經(jīng)制備液相分離，獲得單體化合物。

1.2.3 HPLC ZorbaxSBC18柱（4.6mm×150.0mm，5.0μm）；流動相為乙腈-水；梯度洗脫 0～10 min（60∶40，V/V）、＞10～35 min（80∶20，V/V）、＞35～60 min（90∶10，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長203 nm；進樣體積為20 μL。

2 結(jié) 果

2.1 20（S）-PPT的制備型生物轉(zhuǎn)化 從制備型生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取部分分離得化合物1、2，產(chǎn)率分別為7.48%和11.35%。分子式結(jié)構(gòu)見圖1。

2.1.1 化合物1無色針晶（甲醇） 在核磁共振氫譜1HNMR（CDCl3，500 MHz）中，髙場區(qū)出現(xiàn)了d0.93～1.32的8個甲基單峰質(zhì)子信號，而典型的H-24（d5.17）信號消失，新出現(xiàn)2個末端烯氫信號d4.77（1H，s）和d4.71（1H，s）。同時，在13C-NMR譜中可觀察到31個碳信號，2個新出現(xiàn)的烯碳信號δ106.9和δ156.8，以及一個新出現(xiàn)的次甲基碳信號δ34.2。這些信息提示，底物雙鍵的位置發(fā)生了變化，并且多出一個碳。根據(jù)以上數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)為24-亞甲基-20（S）-PPT。

圖1 Aspergillus niger AS 3.1858對20（S）-PPT的微生物轉(zhuǎn)化

2.1.2 化合物2無色粉末（甲醇） 在1H-NMR（CDCl3，500 MHz）譜中，髙場區(qū)出現(xiàn)了d0.92～1.32的8個甲基單峰質(zhì)子信號，其中有2個甲基質(zhì)子信號發(fā)生重疊，而典型的H-24（d5.17）信號消失，新出現(xiàn)2個烯氫信號d5.17（1H，m）和 d5.55（1H，d，J=16.2 Hz）。此外，在1HNMR中還可觀察到一個甲氧基氫信號d3.16（3H，s）。以上信息提示，底物雙鍵位置發(fā)生改變，且多出一個甲氧基。在13C-NMR譜中可觀察到31個碳信號，且新出現(xiàn)碳信號d125.7、d139.8、d75.2和d50.6。根據(jù)以上數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)為23，24-烯-25-甲氧基-20（S）-PPT。

2.2 培養(yǎng)基條件優(yōu)化

2.2.1 接種量對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，當(dāng)接種量為15%時，有利于Aspergillus niger AS 3.1858菌體的生長和20（S）-PPT的微生物轉(zhuǎn)化。此時菌體呈現(xiàn)細沙狀，菌液濃度較大。化合物1、2的產(chǎn)率分別為15.61%和19.73%。見表1。

表1 接種量對生物轉(zhuǎn)化的影響（%）

2.2.2 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，增加底物濃度，雖然轉(zhuǎn)化的絕對量有所提高，但化合物1、2的產(chǎn)率均持續(xù)降低。底物濃度為0.25 mmol/L時，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率最大。見表2。

表2 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化的影響（%）

2.2.3 轉(zhuǎn)化時間對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化5d時化合物1的產(chǎn)率達到最大值（10.70%），化合物2的產(chǎn)率在5 d時達到最大值（17.30%）。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)化時間對生物轉(zhuǎn)化的影響

2.2.4 溫度對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為26℃時，化合物1、2的產(chǎn)率均最高（12.72%、18.23%）。見表3。

表3 溫度對生物轉(zhuǎn)化的影響（%）

2.2.5 加樣時間對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)接后36h加樣，化合物1、2的產(chǎn)率最大（10.52%、11.87%）。見表4。

表4 加樣時間對生物轉(zhuǎn)化的影響（%）

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對生物轉(zhuǎn)化的影響 實驗結(jié)果顯示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速從120 r/min增加至150 r/min時，化合物1、2的產(chǎn)率均提高（12.16%、17.38%）；此后，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增加，產(chǎn)率又有所下降。綜合考慮，選擇150 r/min作為優(yōu)化的搖床轉(zhuǎn)速。見表5。

表5 搖床轉(zhuǎn)速對生物轉(zhuǎn)化的影響（%）

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化綜合驗證試驗 培養(yǎng)條件優(yōu)化后，化合物1、2的產(chǎn)率分別為17.54%、21.63%，18.37%、22.41%，17.89%、22.47%。結(jié)果表明，經(jīng)過轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化，黑曲霉轉(zhuǎn)化20（S）-PPT獲得化合物1、2的產(chǎn)率均顯著提高。

3 討 論

本實驗以構(gòu)建高效微生物轉(zhuǎn)化體系為目標(biāo)，提高黑曲霉轉(zhuǎn)化20（S）-PPT獲得亞甲基衍生物的能力。以24-亞甲基-20（S）-PPT和23，24-烯-25-甲氧基-20（S）-PPT的產(chǎn)率為指標(biāo)，對可能的影響因素進行了考察，獲得了優(yōu)化的轉(zhuǎn)化工藝。在此工藝條件下，經(jīng)過3次實驗驗證，黑曲霉轉(zhuǎn)化20（S）-PPT獲得上述2個衍生物的產(chǎn)率分別提高了約2.5倍與2.0倍（從“培養(yǎng)條件優(yōu)化綜合驗證試驗”獲得的產(chǎn)率與未優(yōu)化前的產(chǎn)率“制備型生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率”進行比較）。

本實驗結(jié)果還表明，底物濃度與加樣時間是影響生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，其中底物濃度由基礎(chǔ)條件的0.25mmol/L增加到1.00 mmol/L，2種衍生物的產(chǎn)率分別下降了約46.97%和49.59%（表2），并隨著底物濃度的繼續(xù)增加而進一步降低，說明轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化能力有限。

微生物對底物的轉(zhuǎn)化是一個動態(tài)過程，轉(zhuǎn)化時間對產(chǎn)率的影響一般都較大，化合物1、2的產(chǎn)率在加樣后2～3 d增加較快，隨后增加緩慢，產(chǎn)率在第5天達到最大值，達到最大值后由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，菌種生長狀態(tài)發(fā)生變化，可能將產(chǎn)物進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，產(chǎn)率達到最大值后不斷減小。因此，轉(zhuǎn)化時間控制在4～5 d較好。同時，接種量、培養(yǎng)溫度與搖床轉(zhuǎn)速對衍生物的生成都有一定程度的影響。

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Microbial transformation and condition optimization of 20（S）-protopanaxatriol by Aspergillus niger AS 3.1858

Yan Bin，Zou Baohua
（Jinhua Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Nantong，Jiangsu 226005，China）

ObjectiveTo construct a new synthetic route to prepare 20（S）-protopanaxatriol by using the microbial transformation method，to optimize the transformation condition for increasing the yield rate of the transformation products..MethodsAspergillus niger AS 3.1858 was selected as the transformation bacterial strain.The transformation conditions were optimized in the aspects of inoculated bacterial quantity，substrate concentration，transformation time，sampling time，temperature and rotational speed.ResultsTwo derivatives 24-methylene-20（S）-protopanaxatriol and 23，24-en-25-methoxyl-20（S）-protopanaxatriol were obtained；the optimized transformation technology was obtained，the inoculation amount was15%，the substrate concentration was 0.25 mmol/L，the sample adding time was at 36 h after inoculation，the culture time was 26℃，the transformation time was 5 d and the shaking speed was 15 r/min.ConclusionThis microbial transformation method can simply obtain the derivatives of 20（S）-protopanaxatriol.The yield rate of 24-methylene-20（S）-protopanaxatriol and 23，24-en-25-methoxyl-20（S）-protopanaxatriol could be greatly increased by adopting the optimized condition.

Panaxatriol/analogs&derivatives； Aspergillusniger； Fermentation； Culture media； Biotransformation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.18.004

A

1009-5519（2015）18-2736-03

2015-05-15）

嚴(yán)賓（1980-），男，江蘇南通人，碩士研究生，工程師，主要從事醫(yī)藥化工研究工作；E-mail：yanbin19800918@163.com。