唐加步，曹 軍，姚運(yùn)紅，曾 超（.廣東醫(yī)學(xué)院東莞校區(qū)病理學(xué)教研室，廣東東莞53808；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣東湛江54000）

ER C-erbB-2和CyclinB1在人乳腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

唐加步1，曹 軍2，姚運(yùn)紅1，曾 超1
（1.廣東醫(yī)學(xué)院東莞校區(qū)病理學(xué)教研室，廣東東莞523808；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣東湛江524000）

目的探討雌激素受體（ER）、細(xì)胞原癌基因C-erbB-2和細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測2010～2013年接受乳腺癌根治術(shù)的70例患者乳腺癌組織中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表達(dá)，觀察其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌病理類型、腫瘤大小、組織分級等的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌組織中ER的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.329，P＜0.01），C-erbB-2、CyclinB1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.467、0.548，P＜0.01），CyclinB1的表達(dá)與組織分級和腫瘤大小呈顯著相關(guān) （r=0.589、0.568，P＜0.01）；ER和C-erbB-2的表達(dá)與病理類型、腫瘤大小、組織分級等均無相關(guān)性（P＞0.05）；CyclinB1的表達(dá)與病理類型無相關(guān)性（P＞0.05）。乳腺癌組織中ER與C-erbB-2、CyclinB1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.402、-0.376，P＜0.01）。結(jié)論聯(lián)合檢測乳腺癌組織中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表達(dá)有助于乳腺癌預(yù)后的判斷，對指導(dǎo)治療和提高療效有重要意義。

免疫組織化學(xué)； 乳腺腫瘤； 受體，雌激素； 基因，erbB-2； 細(xì)胞周期蛋白類； 基因表達(dá)； 淋巴轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病年齡趨向年輕化，且發(fā)病率不斷上升。雌激素受體（ER）及相關(guān)腫瘤基因的表達(dá)與乳腺癌關(guān)系密切。本研究采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法檢測70例乳腺癌組織中ER、細(xì)胞原癌基因C-erbB-2和細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）的表達(dá)，旨在討論三者與乳腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本組70例乳腺癌患者均于2012～2013年接受乳腺癌根治術(shù)，所有病例標(biāo)本均來自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，均按WHO乳腺腫瘤的組織類型分類，患者年齡16～67歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療，病理資料完整。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛液固定，石蠟包埋。4 μm連續(xù)切片，每個蠟塊均有蘇木精-伊紅（HE）染色對照片。

1.1.2 試劑 ER、C-erbB-2基因單克隆抗體、CyclinB1、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒及SP試劑盒均為即用型（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。粘片劑氨醛酸乙基硅（APES）由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 觀察乳腺癌組織中ER、C-erbB-2和CyclinB1的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌病理類型、腫瘤大小、組織分級等病理指標(biāo)的關(guān)系。

1.2.2 免疫組化方法 用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照；用不加一抗的切片作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。（1）ER免疫組化SP法操作步驟：將APES與丙酮按1∶50稀釋，然后涂于清潔的載玻片上，使其自然干燥。將石蠟組織制成4 μm厚切片，取片后放置于58～60℃烤箱中30～60 min，使切片緊密黏附，常規(guī)脫蠟、水洗；3%過氧化氫（H2O2）孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS水洗，每次1 min，洗3次；置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中加熱至90～100℃10 min使抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS水洗，每次1 min，洗3次；然后用山羊血清保護(hù)抗原孵育10 min；傾去血清，滴加一抗[1∶5稀釋的抗ER和孕激素受體（PR）的單抗]，置于4℃冰箱過夜；PBS水洗，每次3 min，洗3次，滴加二抗工作液，室溫孵育30 min；PBS水洗，每次3 min，洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈激酶卵白素工作液，室溫孵育30 min；PBS水洗，每次3 min，洗3次，DAB顯色，鏡下監(jiān)視至細(xì)胞著色；自來水充分水洗，蘇木素復(fù)染，封片。（2）CyclinB1、C-erbB-2免疫組化SP法操作步驟：將APES與丙酮按1∶50稀釋，涂至清潔載玻片上，自然干燥；將石蠟組織制成4 μm厚切片，撈片后置烤箱58～60℃30～60 min，使切片緊密黏附，常規(guī)脫蠟水洗；蒸餾水新鮮制備3%H2O2，室溫孵育5～10 min，滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水水洗，每次 1 min，洗3次；微波修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，置于微波爐內(nèi)加熱至96～100℃，持續(xù)20 min，冷卻至室溫，滴加抗原修復(fù)液，室溫放置10 min，蒸餾水水洗，每次1 min，洗3次；加正常工作血清封閉液50 μL，室溫放置10 min，甩去多余液體，不洗，加一抗（1∶50稀釋的抗CyclinB1和C-erbB-2單抗50 μL），置4℃冰箱過夜，用PBS水洗，每次1 min，洗3次；加生物素化山羊抗小鼠IgG50μL，室溫放置20min，PBS水洗，每次1min，洗3次；加HIGH-SABC（高敏感性鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶）50 μL，室溫放置20 min，PBS水洗，每次3 min，洗3次；DAB顯色，室溫放置20 min，鏡下控制反應(yīng)時間，自來水終止顯色，HE輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.2.3 乳腺癌組織中ER、C-erbB-2、CyclinB1陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn) 乳腺癌組織中ER陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，陽性反應(yīng)為核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒；CyclinB1陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，陽性反應(yīng)為核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒；C-erbB-2基因定位于細(xì)胞膜，陽性反應(yīng)為細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒。分別由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生采用雙盲法觀察至少5個具有代表性的高倍視野（400×），不少于1 000個細(xì)胞，染色細(xì)胞數(shù)超過10%者判斷為ER、C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)陽性，否則為表達(dá)陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 ER在乳腺癌組織中的表達(dá)（SP法，400×）

圖2 CyclinB1在乳腺癌組織中的表達(dá)（SP法，400×）

圖3 C-erbB-2在乳腺癌組織中的表達(dá)（SP法，400×）

表1 乳腺癌組織中ER、C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（n）

2.1 乳腺癌組織中ER、C-erbB-2、CyclinB1陽性表達(dá)結(jié)果 3種基因在乳腺癌組織中的表達(dá)見圖1～3。

2.2 乳腺癌組織中ER、C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 表1結(jié)果顯示，ER、C-erbB-2及CyclinB1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.565、15.260、20.992，P＜0.05），乳腺癌組織中ER的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.329，P＜0.01），而C-erbB-2、CyclinB1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r= 0.467、0.548，P＜0.01）。CyclinB1的表達(dá)與組織分級和腫瘤大小呈顯著正相關(guān)（r=0.589、0.568，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.306、22.607，P＜0.01）而與病理類型無相關(guān)性（P＞0.05）。ER和C-erbB-2的表達(dá)與病理類型、腫瘤大小、組織分級等均無相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3 乳腺癌組織中ER與C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)的關(guān)系 70例乳腺癌組織中ER與C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.402、-0.376，P＜0.01），見表2。

表2 乳腺癌組織中ER與C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)的關(guān)系（n）

3 討 論

乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤，近年來關(guān)于ER在乳腺癌中的作用研究較多。有研究表明，乳腺癌患者預(yù)后的判斷、治療及其生物學(xué)行為均與ER存在一定關(guān)系[1-2]。ER是一種有特定功能的蛋白質(zhì)，能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的分化和生長，但在細(xì)胞癌變過程中，其成分隨著細(xì)胞分化程度高低而受到較大影響，因低分化而出現(xiàn)丟失或部分丟失。內(nèi)分泌治療對ER陽性患者效果較好，臨床上運(yùn)用較多。本研究結(jié)果顯示，ER的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.329，P＜0.01）。提示ER表達(dá)陰性的淋巴結(jié)可能會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、腫瘤惡性程度高、預(yù)后不良。因此，對于ER陰性的患者，即便是未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，也應(yīng)當(dāng)重視其術(shù)后的綜合治療。但本研究未發(fā)現(xiàn)ER的表達(dá)與病理類型、腫瘤大小、組織分級有關(guān)，與崔潔等[3]的研究結(jié)果一致。

細(xì)胞原癌基因C-erbB-2位于人體第17號染色體q21帶上，具有酪氨酸激酶活性，參與正常細(xì)胞的生長、分化和分裂，當(dāng)受到體內(nèi)外某些因素作用后可被激活，從而具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性[4-5]。在人類乳腺癌病變和發(fā)展過程中，其主要的激活方式是基因擴(kuò)增，促進(jìn)癌細(xì)胞運(yùn)動加速，從而導(dǎo)致癌瘤深部浸潤及轉(zhuǎn)移。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，C-erbB-2在乳腺癌中的表達(dá)與組織分級、基因蛋白、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。C-erbB-2與其他預(yù)后因子相比更有價值，被認(rèn)為是第2位且有預(yù)后意義的指標(biāo)，與ER的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，C-erbB-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.476，P＜0.01），支持其作為乳腺癌判斷預(yù)后重要指標(biāo)的結(jié)論。C-erbB-2與ER表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，對乳腺癌ER、PR陽性者進(jìn)行內(nèi)分泌治療效果良好，預(yù)后較好；如C-erbB-2表達(dá)水平過高，說明癌基因被激活，癌細(xì)胞分化減弱，甚至停滯，同時，乳腺癌依賴激素生長的特性也相應(yīng)受到抑制，內(nèi)分泌治療因癌細(xì)胞分化降低而使效果較差或無效果[7]。本研究70例乳腺癌組織中C-erbB-2的陽性表達(dá)率為65.7%（46/70），高于國外文獻(xiàn)報道[8]，與國內(nèi)學(xué)者報道乳腺癌中C-erbB-2基因的過度表達(dá)率為9.0%～66.0%（平均19.5%）相符[9]，這是否與種族和地理環(huán)境有關(guān)值得進(jìn)一步探討。

有研究表明，參與乳腺癌發(fā)病機(jī)制的學(xué)說有多種，但諸多學(xué)者認(rèn)為多與某些因子的異常表達(dá)有關(guān)，而這種基因是由多種細(xì)胞周期調(diào)控因子的異常表達(dá)所導(dǎo)致的[10-11]。CyclinB1的過度表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)和增殖指數(shù)有關(guān)[12-13]，而過表達(dá)的CyclinB1對G2/M調(diào)控產(chǎn)生干預(yù)，促進(jìn)了細(xì)胞的異常分裂和增殖。本研究也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中存在CyclinB1的過表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.548，P＜0.01），與組織分級和腫瘤大小呈顯著正相關(guān)（r=0.589、0.568，P＜0.01）。腫瘤越大、病程越晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多則CyclinB1的陽性表達(dá)越高。由此可見，CyclinB1的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和低分化密切相關(guān)，是乳腺組織發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要因素，說明CyclinB1可作為判斷乳腺癌細(xì)胞分裂、增殖能力的有效指標(biāo)，并有助于判斷患者的預(yù)后。

綜上所述，乳腺癌組織中ER和C-erbB-2、CyclinB1表達(dá)的相關(guān)性研究顯示，對乳腺癌患者進(jìn)行ER、C-erbB-2和CyclinB1聯(lián)合檢測有助于乳腺癌預(yù)后的判斷，對指導(dǎo)臨床治療和提高療效具有重要意義。

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Expressions of estrogen receptor，C-erbB-2 and CyclinB1 in breast carcinoma and their correlation

Tang Jiabu1，Cao Jun2，Yao Yunhong1，Zeng Chao1
（1.Teaching and Researching Section of Pathology，Dongguan Campus of Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 523808，China；2.Department of Pathology，Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 524000，China）

ObjectiveTo study the expressions of estrogen receptor（ER），C-erbB-2 and CyclinB1 in breast carcinoma tissues and their correlations.MethodsThe immunohistochemical SP method was adopted to detect the expressions of ER，C-erB-2 and CyclinB1 in the samples of breast carcinoma tissue from 70 patients receiving breast cancer radical operation during 2010-2013.Their relation with the lymph node metastasis，breast cancer pathological types，tumor size and histological grade was observed.ResultsThe ER expression in breastcancer had a negative correlation with lymph node metastasis（r=-0.329，P＜0.01）.The positive correlation was found between lymph node metastasis with expressions of C-erbB-2 and CyclinB1（r=0.467，0.548，P＜0.01）. Moreover，the CyclinB1 expression was significantly correlated with the histological type and tumor size（r=0.589，0.568，P＜0.01）；the expression of ER and C-erbB-2 had no correlated with the pathological types，tumor size and histological types（P＞0.05）；no correlation was found between the CyclinB1 expression and the pathological types（P＞0.05）.The ER expression had a significantly negative correlation with expressions of C-erbB-2 and CyclinB1 in breast cancer tissues（r=-0.402，-0.376，P＜0.01）.ConclusionThe combined detection of ER，C-erbB-2 and CyclinB1 in breast cancer tissues is conducive to the judgment of breast cancer prognosis and has an important significance to guide the treatment and increase the curative effect.

Immunohistochemistry； Breast neoplasms； Receptors，estrogen； Genes，erbB-2； Cyclins； Gene expression； Lymphatic metastasis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.18.002

A

1009-5519（2015）18-2730-03

2015-06-02）

唐加步（1974-），男，廣東化州人，講師，主要從事腫瘤病理學(xué)教學(xué)與研究工作；E-mail：zjtangjb08@hotmail.com。