侯文匯 李銀廣 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游澤山

基礎(chǔ)研究論著

不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者FOXP3基因蛋白表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化水平之間關(guān)系的研究

侯文匯 李銀廣 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游澤山

目的探討不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(URSA)患者蛻膜組織中叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3(FOXP3)基因的蛋白表達(dá)水平及其與啟動(dòng)子甲基化水平的關(guān)系。方法利用蛋白印跡法檢測(cè)20例URSA患者(URSA組)和20名正常妊娠主動(dòng)要求人工流產(chǎn)術(shù)的健康婦女(正常對(duì)照組)蛻膜組織中FOXP3蛋白表達(dá)情況，利用結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法(BSP)檢測(cè)2組FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化情況，并分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果URSA組蛻膜組織中FOXP3表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。BSP顯示URSA組FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。FOXP3蛋白表達(dá)水平與FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.917，P<0.01)。結(jié)論FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化水平升高后，F(xiàn)OXP3基因蛋白表達(dá)水平下調(diào)，引起免疫耐受異常，可能導(dǎo)致RSA的發(fā)病。

不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3；基因啟動(dòng)子；甲基化

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)是指連續(xù)2次或2次以上(與同一性伴侶)的自然流產(chǎn)，其病因較復(fù)雜，除胚胎或流產(chǎn)夫婦的染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染等傳統(tǒng)經(jīng)典的四大原因外，約有40%～50%的患者原因不明，稱(chēng)原因不明RSA(URSA)。國(guó)內(nèi)外研究表明，RSA與母胎免疫耐受的異常有關(guān)[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在母胎免疫耐受形成中起關(guān)鍵性作用，且Treg的形成和功能發(fā)揮又需要叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3 (FOXP3)基因的穩(wěn)定持續(xù)和高水平表達(dá)[2-3]。有報(bào)道，URSA患者外周血和蛻膜組織中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少且其功能受損，尤以蛻膜組織中明顯[4-5]。另有學(xué)者報(bào)道，URSA患者存在FOXP3基因的低表達(dá)[5]。然而筆者尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)深入研究FOXP3基因低表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制。本研究試圖從FOXP3基因表觀遺傳學(xué)方面探討其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，進(jìn)而為RSA的防治開(kāi)辟新思路。

材料和方法

一、標(biāo)本

1.URSA組

2012年至2014年在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)行清宮術(shù)的RSA患者，年齡25～41歲，中位年齡32歲。按以下標(biāo)準(zhǔn)納入：流產(chǎn)次數(shù)≥2次，流產(chǎn)均發(fā)生在孕12周以前，胚胎絨毛染色體核型正常，絨毛全基因組高通量測(cè)序無(wú)微缺失或微重復(fù)。排除常見(jiàn)的夫婦雙方染色體異常、女方生殖道畸形、基礎(chǔ)性激素及黃體功能異常、男方精液檢查異常。本研究選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的20例患者作為實(shí)驗(yàn)組。

2.正常妊娠主動(dòng)要求人工流產(chǎn)患者(正常對(duì)照組)

同期在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)正常妊娠主動(dòng)要求人工流產(chǎn)術(shù)的健康婦女，年齡25～41歲，中位年齡31歲，孕8～12周。按以下標(biāo)準(zhǔn)納入：至少有1次成功妊娠史，無(wú)自然流產(chǎn)或死胎史，此次B超顯示正常，絨毛染色體核型正常，絨毛全基因組高通量測(cè)序提示無(wú)微缺失或微重復(fù)。本研究選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的20例患者作為對(duì)照組。

3.標(biāo)本采集

于清宮術(shù)中取出2組患者的胎盤(pán)蛻膜組織，洗凈，迅速放入液氮中凍存，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)中山大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每位參與者均被詳細(xì)告知研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑

包括基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))、DNA亞硫氫酸鹽處理純化試劑盒(Qiagen，德國(guó))、DNA凝膠回收試劑盒(Qbiosource，美國(guó))、Amp(Amresco，美國(guó))、DH5a感受態(tài)細(xì)胞(廣譽(yù)生物，中國(guó))、蛋白提取液(碧云天生物，中國(guó))、十二羥硫酸鈉(SDS，廣州威佳)、甲醇 (廣州化學(xué)試劑廠)、吐溫-20(Sigma，美國(guó))、脫脂奶粉(伊利)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio Rad，美國(guó))、兔抗人FOXP3多抗(CST 美國(guó))、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗(博士德，中國(guó))、ECL顯色試劑盒(凱基生物)，重蒸水由Millpore純水機(jī)制備，蛋白胨、酵母提取物均為英國(guó)Oxiod公司產(chǎn)品，2倍Fast Pfu酶預(yù)制混合物、T載體、T4 DNA 連接酶均為中國(guó)近岸生物科技有限公司產(chǎn)品，乙醇、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

三、方法

1.蛻膜FOXP3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

使用蛋白免疫法檢測(cè)。常規(guī)蛋白提取法提取蛻膜組織總蛋白，各組樣品分別取總蛋白50 μg，5%的Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉，加入稀釋度為1∶1 000的一抗磷酸鹽緩沖液(PBS)常溫孵育2 h，以管家基因GAPDH(1∶1 500)為內(nèi)對(duì)照。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(稀釋度為1∶2 500)，常溫孵育1 h，洗膜5次后，用ECL發(fā)光液1 ml顯影，X光法曝光，成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.組織DNA的提取

按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)所列的步驟在無(wú)菌條件下提取蛻膜組織DNA。

3.FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)

采用結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法(BSP)，對(duì)所提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，步驟參照DNA亞硫氫酸鹽處理純化試劑盒說(shuō)明書(shū)：將20 μl DNA樣品與150 μl的轉(zhuǎn)化試劑混合均勻，將混勻的轉(zhuǎn)化體系在PCR儀中98℃ 10 min，64℃放置5 h。將反應(yīng)液與600 μl結(jié)合緩沖液混合，加到離心柱中，10 000×g離心30 s，棄濾液。加洗滌緩沖液200 μl，10 000×g離心30 s，棄濾液。65℃預(yù)熱洗脫緩沖液，將離心柱放入新的離心管中，加入30 μl洗脫緩沖液，10 000×g離心1 min，收集洗脫產(chǎn)物即為純化的甲基化處理的DNA樣品。用修飾后的DNA為模板進(jìn)行PCR(上游引物5’-TATAATTAAGAAAAGGAGAAATATAGAGAG-3’；下游引物5’-TAAAACCCACATCTAATAAAAAAAA-3’)?？偡磻?yīng)體系統(tǒng)50 μl：2倍Fast Pfu酶預(yù)制混合物25 μl，DNA模板5 μl，上、下游引物各2.5 μl，重蒸水15 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s、62℃退火15 s、72℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下切下目的條帶。將凝膠回收的PCR產(chǎn)物連接入T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布APM抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆10個(gè)，送往上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。研究表明，F(xiàn)OXP3基因在啟動(dòng)子區(qū)(-250 ～ +1 bp)，存在8個(gè)高度保守的CpG二核苷酸甲基化位點(diǎn)，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后未甲基化的胞嘧啶(C)均被轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(T)，而被甲基化的C未被轉(zhuǎn)化。比較2組蛻膜組織的FOXP3基因CpG位點(diǎn)甲基化水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、URSA組與正常對(duì)照組蛻膜組織的FOXP3蛋白水平比較

URSA組蛻膜組織的FOXP3蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(0.525±0.135vs. 0.817±0.191，t= 4.782、P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 URSA組與正常對(duì)照組蛻膜組織的FOXP3蛋白表達(dá)水平比較

二、URSA組與正常對(duì)照組蛻膜組織的FOXP3基因甲基化水平比較

URSA組FOXP3基因甲基化位點(diǎn)甲基化水平明顯高于對(duì)照組(0.859±0.059vs. 0.712±0.099，t= 5.673、P< 0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 URSA組與正常對(duì)照組蛻膜組織的FOXP3基因啟動(dòng)子甲基化水平比較

三、FOXP3蛋白表達(dá)與基因甲基化的關(guān)系

FOXP3蛋白表達(dá)水平與基因甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.917，P<0.001)。

討 論

研究表明，正常妊娠是一種成功的半同種異體移植現(xiàn)象，其關(guān)鍵在于母胎免疫耐受的形成使孕婦對(duì)胚胎半同種異體抗原不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。因此免疫耐受一旦被打破，就可能出現(xiàn)RSA等不良妊娠現(xiàn)象[6]。研究表明，RSA與免疫耐受有關(guān)[1]。Treg尤其是CD4+CD25+T細(xì)胞在母胎免疫耐受的形成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。最近，有學(xué)者提出用一種更合理、更符合自然流產(chǎn)發(fā)病原因復(fù)雜和多變性的模式，闡釋免疫耐受異常導(dǎo)致RSA的發(fā)病機(jī)制，即免疫調(diào)節(jié)相關(guān)Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞模式：自然流產(chǎn)患者外周血及蛻膜組織中在免疫耐受的誘導(dǎo)和維持中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的Treg細(xì)胞明顯低于正常妊娠者，而分泌多種促炎因子的Th1及Th17細(xì)胞明顯升高，這打破了正常妊娠的免疫耐受模式而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)病[7-11]。

FOXP3屬于人類(lèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，特異性的表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞。FOXP3基因的穩(wěn)定持續(xù)和高水平表達(dá)是Treg的形成和功能發(fā)揮的關(guān)鍵[2-3]。梅珊珊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者外周血和蛻膜組織中Treg 細(xì)胞FOXP3表達(dá)比例低于正常早期妊娠婦女，且蛻膜局部FOXP3的變化較外周血更為靈敏。楊卉等[13]分別用免疫組織化學(xué)染色法、半定量和實(shí)時(shí)定量PCR法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)URSA患者蛻膜組織中FOXP3表達(dá)明顯低于正常早期妊娠婦女。本研究采用蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)URSA患者和正常早期妊娠婦女蛻膜組織的FOXP3表達(dá)，URSA組明顯低于正常對(duì)照組，與前述報(bào)道基本一致。由此推測(cè)。FOXP3可能參與母胎界面妊娠免疫調(diào)節(jié)，其蛻膜組織中表達(dá)下降可能與RSA的發(fā)生有關(guān)。

然而FOXP3下調(diào)引起URSA具體的發(fā)生機(jī)制仍不明確。近年研究表明FOXP3長(zhǎng)期和穩(wěn)定的存在離不開(kāi)以DNA 甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。已有研究證實(shí)，人類(lèi)自然Treg中FOXP3的穩(wěn)定表達(dá)需要以DNA甲基化為基礎(chǔ)的表觀遺傳學(xué)修飾來(lái)控制。余鑫海等[14]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性干燥綜合征患者Treg中FOXP3表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制與FOXP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化有關(guān)。然而，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)關(guān)于URSA患者甲基化水平的報(bào)道。本研究采用BSP法檢測(cè)2組蛻膜組織FOXP3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，結(jié)果顯示URSA組蛻膜FOXP3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平明顯高于正常對(duì)照組，且FOXP3蛋白表達(dá)水平與基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，提示在RSA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)OXP3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了甲基化，導(dǎo)致蛋白表達(dá)的減少或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致Treg細(xì)胞不能發(fā)揮免疫抑制作用，不利于正常母-胎免疫耐受的形成，從而導(dǎo)致RSA的發(fā)病。

綜上所述，本研究初次從表觀遺傳學(xué)角度討論URSA患者蛻膜組織FOXP3低表達(dá)可能由FOXP3基因啟動(dòng)子高水平的甲基化引起，使Treg免疫抑制功能受損，打破母胎免疫耐受，導(dǎo)致RSA的發(fā)病。

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AssociationbetweenFOXP3promotermethylationandtheexpressionofFOXP3proteininunexplainedrecurrentspontaneousabortion

HouWenhui，LiYinguang，LiZhuyu，LiJie，F(xiàn)angLiyuan，LiXiaoqing,YouZeshan.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

，YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

ObjectiveTo investigate the association between the level of FOXP3 promoter methylation and the expression level of FOXP3 protein in the decidua of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA).MethodsThe expression levels of FOXP3 protein in the decidua of 20 URSA patients and 20 healthy counterparts who underwent induced abortion were assessed by Western blot. Bisulfite-assisted genomic sequencing PCR (BSP) was utilized to detect the levels of FOXP3 promoter methylation. The correlation between two indexes was evaluated.ResultsThe expression level of FOXP3 in the decidua of the URSA group was significantly lower than that of the control group (P<0.01), whereas the level of FOXP3 promoter methylation in the URSA group was significantly higher compared with that in the control group(P<0.01). The expression level of FOXP3 protein was negatively correlated with the level of FOXP3 promoter methylation (r=-0.917,P<0.01).ConclusionAs the level of FOXP3 promoter methylation increases, the expression level of FOXP3 protein is down-regulated, which may cause abnormal immune tolerance and potentially lead to the incidence of RSA.

Unexplained recurrent spontaneous abortion; FOXP3; Promoter; Methylation

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.09.006

廣東省自然科學(xué)基金(S2011010003522)

510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(侯文匯，李銀廣，李珠玉，李婕，李小青，游澤山)；510010 廣州，廣東省婦幼保健院(方利元)

，游澤山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

2015-04-23) (本文編輯：林燕薇)